河南地区猪嵴病毒分子检测和VP1基因遗传进化分析

猪嵴病毒（PKV）为新发现的小RNA病毒科嵴病毒属的一个待定种。为调查PKV在河南地区猪群中的感染和流行情况，本研究采集2010年~2012年河南地区84个种猪场150份猪腹泻粪便样品和23份无腹泻症状猪的粪便样品（猪场有腹泻史），采用RT．PCR方法对PKV的VP1基因进行检测。结果显示，检测样品中PKV总阳性率为82．1％（142／173），猪场PKV总阳性率为82．1％（69／84），表明河南地区各种猪群普遍存在PKV感染。其中发病猪群的PKV总阳性率为80．0％（120／150），临床健康猪群的PKV总阳性率为95．7％（22／23），两者无明显差异。此外，对8个阳性样品中VP1基因进行测序比对，结果显示与中国其它地区的PKVvP1基因的核苷酸同源性为80．7％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为83．9％～99．6％。遗传进化分析显示所有已知的PKV株构成4个分支，河南的8个PKV的VP1序列分别位于其中的3个分支中。

河北省鸡群鸭源鸡杆菌血清流行病学调查

为了解鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis)在河北省鸡群中的感染状况,采用乳胶凝集试验对河北省10个不同地市的677份鸡血清样品进行了鸭源鸡杆菌的血清流行病学调查,对鸭源鸡杆菌的感染率进行分析。结果表明:河北省不同地区鸡群均存在鸭源鸡杆菌感染,平均阳性率为48.60%,其中血清Ⅰ型抗体阳性率为29.54%,血清Ⅱ型抗体阳性率为29.69%,血清Ⅳ型抗体阳性率为22.16%。不同地市的鸡群血清阳性率存在一定差异,其中张家口和石家庄的鸭源鸡杆菌血清阳性率较高,分别为72.73%和80.95%。

基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺(病毒种毒来源、MOI及收获时间),为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆(PK15-1C8、2F11、1E5)按照1×10^(6)细胞/m L的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒(来源于贴壁细胞或悬浮细胞),摸索感染MOI(0.1、0.2、0.5)及收获时间(48、72、96、120h),确定PCV2最佳生产工艺。【结果】(1)贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10^(6)/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10^(6)/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;(2)3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^(6.4)TCID_(50)/mL,克隆PK15-2F11(10^(5.5)TCID_(50)/mL)、PK15-1E5(10^(5.6)TCID_(50)/mL),3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆(10^(4.7)TCID_(50)/mL),但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;(3)使用贴壁细胞来源的种毒(10^(6.4)TCID_(50)/mL)感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10^(6)/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^(6.5)TCID_(50)/mL。以来源于悬浮细胞的种毒(10^(6.3)TCID_(50)/mL)感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^(7.3)TCID_(50)/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10^(6)/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^(7.3)TCID_(50)/mL,可用于工厂化疫苗生产。

鸭源鸡杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

利用鸭源鸡杆菌YU-PDS-RZ-1-SLG分离株制备超声波裂解抗原,建立了可以检测鸭源鸡杆菌多个血清型抗体的间接ELISA方法。包被抗原质量浓度为10mg/L,包被条件为37℃2h,再4℃过夜;封闭液为1%明胶,封闭条件为37℃1h;阴、阳性血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗工作滴度为1∶1 000;底物显色时间为15min。经交叉性试验、阻断试验和重复性试验证实建立的ELISA方法重复性好,特异性强。板内变异系数为2.01%～5.75%,板间变异系数为2.43%～6.20%。间接ELISA方法的灵敏度是微量凝集试验的25～100倍。利用所建立的ELISA方法检测了人工感染鸭源鸡杆菌的4日龄SPF鸡在感染后不同阶段感染组、同居组和空白对照组的血清抗体,并根据感染后不同阶段所测D450值绘制抗体消长曲线,其抗体水平在感染后32～47d开始上升,60d时达到高峰,但维持时间较短,2周后迅速下降。建立的间接ELISA方法可以用于临床病例的血清学快速检测,为进行鸭源鸡杆菌的血清流行病学调查提供了手段。

猪链球菌血清2型抗体IHA检测方法的建立及应用

用猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)致敏经戊二醛处理过的鸡红细胞,优化致敏醛化红细胞的抗原量和时间。结果显示,在37℃条件下CPS(2.2 5mg/L)致敏鸡红细胞90min,IHA试验在25℃条件下操作,被检血清IHA效价在1∶8及其以上时判为SS2抗体阳性。应用此方法对猪大肠杆菌、副嗜血杆菌、猪肠球菌、SS1、SS7、SS9、金黄色葡萄球菌、沙门菌、巴氏杆菌阳性血清进行检测,结果表明,SS2抗体均为阴性。对1044份无临床症状的猪血清进行检测,SS2抗体阳性率为61.69%。该方法敏感性高,特异性较强,可用于大规模SS2抗体水平的检测和SS2的血清流行病学调查。