小鼠禁食-再喂养后免疫相关基因及途径的识别

目的利用生物信息学方法筛选脂肪组织响应营养信号变化的免疫相关基因及途径。方法对禁食24 h或禁食后再恢复喂养小鼠白色脂肪组织进行RNA二代测序,筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),与免疫相关基因(immune-related genes,IRGs)取交集,进行基因本体(gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路分析。从STRING数据库构建的蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)中提取重要模块,联合cytoHubba筛选出Hub基因,采用RT-qPCR法检测Hub基因的表达,并对其在禁食再喂养组小鼠中的表达量进行Pearson相关性分析。结果筛选出的差异表达基因中上调基因52个、下调基因244个。GO和KEGG分析结果显示,富集的通路及生物过程主要涉及淋巴细胞活化、细胞因子受体相互作用、免疫应答的激活等。筛选出的评分最高的10个Hub基因分别是Itk、Lcp2、Lat、Vav1、Syk、Grap2、Zap70、Lck、Plcg2、Cd247。RT-qPCR结果显示,与禁食组相比,再喂养组所有的Hub基因的mRNA表达水平降低(P<0.01)。结论筛选出10个响应禁食的Hub基因,为进一步揭示营养信号变化对不同免疫细胞水平的影响奠定了生物学基础,为制定合理饮食方案提供新的思路。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2膜蛋白对宿主细胞pre-mRNA 3'UTR加工的影响

目的研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)膜蛋白对宿主细胞mRNA前体(pre-mRNA)3’非翻译区(UTR)加工的影响。方法本研究以人肺上皮细胞系A549为模型,利用瞬时转染在细胞内过表达SARS-CoV-2膜蛋白;利用RNA-Seq测序技术及生物信息学分析方法,系统性描绘宿主细胞选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)事件;Metascape数据库对发生显著APA变化的基因进行功能富集分析;RT-qPCR验证靶基因3’UTR长度变化;蛋白质免疫印迹(Western blot)检测目的蛋白表达水平。结果SARS-CoV-2膜蛋白外源表达后宿主细胞内共813个基因发生显著APA变化。GO和KEGG分析显示,差异APA基因广泛参与有丝分裂细胞周期、调节细胞应激等生物过程,涉及病毒感染和蛋白质加工等。从中进一步筛选出AKT1基因,在IGV软件中显示3’UTR延长;RT-qPCR验证AKT1基因的3’UTR长度变化趋势;Western blot结果显示AKT1蛋白磷酸化水平增加。结论SARS-CoV-2膜蛋白潜在影响宿主pre-mRNA的3’UTR加工,其中参与多种病毒性生物过程的AKT1基因3’UTR延长,且其编码的蛋白质功能在细胞内被激活。

CPSF6在胶质母细胞瘤进展中的作用及相关调控机制研究

目的:研究mRNA前体切割和多聚腺苷酸化特异性因子6(polyadenylation specific factor 6,CPSF6)对人胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)细胞系U87和U251的增殖、迁移、侵袭以及ATP水平的影响,进一步探究其相关调控机制。方法:通过Western blot和免疫组化检测CPSF6在GBM组织中的表达水平,利用在线数据库分析CPSF6在GBM组织和配对的非肿瘤组织中的表达水平,同时分析CPSF6与GBM的组织学级别和患者预后的关系。构建敲低CPSF6的U87和U251稳定表达细胞株,并采用RT-qPCR和Western blot方法分别验证U87和U251细胞中CPSF6的敲低效率;利用CCK8和Transwell实验分别检测CPSF6敲降对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;ATP实验检测细胞内的ATP水平变化,确定CPSF6在GBM中的致癌作用。通过RNA-seq分析敲低CPSF6后GBM内mRNA 3′UTR变化情况,KEGG富集分析差异靶基因相关的信号通路。在富集出的信号通路指示下,利用透射电镜和Western blot实验进一步验证敲低CPSF6后GBM自噬的发生情况。结果:CPSF6在GBM组织中呈现出高表达,其表达水平随组织学级别的增加而升高,且与患者不良预后相关。在U87和U251中敲低CPSF6后,细胞的增殖、迁移及侵袭能力均明显降低,细胞内ATP水平下降。对RNA-seq结果分析表明,敲低CPSF6后发生3′UTR缩短事件的基因远多于3′UTR延长事件的基因;KEGG富集到自噬信号通路与肿瘤进展密切相关,透射电镜和Western blot实验验证敲低CPSF6可以促进自噬通路的激活。结论:CPSF6在GBM中高表达,且与GBM的组织学级别和患者不良预后呈正相关,CPSF6可能通过抑制自噬通路的激活来促进U87和U251细胞的增殖、迁移、侵袭以及ATP的生成,进而促进GBM发生、发展。