集胞藻的随机插入诱变和光激活异养突变株的筛选

以４－碱基限制性内切酶部分酶切集胞藻ＰＣＣ６８０３基因文库总质粒ＤＮＡ，并插入卡那霉素抗性基因标记，构建了二级随机插入诱变文库。以该诱变文库总ＤＮＡ转化集胞藻ＰＣＣ６８０３，得到大量有抗性标记基因随机插入的转化子。利用这一方法获得了不能迸行光激活异养生长的突变株，并克隆了抗性标记基因插入部位 ＤＮＡ片段。在持续光照但加 ＤＣＭＵ抑制光合作用的情况下，这些突变株仍然能够利用葡萄糖异养生长，推测突变基因与短时光信号的感应有关。

高效灭蚊幼转基因蓝藻的研究——Ⅰ.蚊虫孳生地蓝藻的分离及对蚊幼虫适口性的观察

本文报告了两种蚊虫孳生地分布的蓝藻Synechocystks sp和Oscillatoria sp.的分离,并发现Anabaena sp.7120株可在城市污水中生长。以上三种蓝藻在自然水和培养条件下生活状态各不相同,但皆可作为蚊幼虫食物。其中,Oscillatoria sp.藻丝长而交织生长,藻体集结成块,仍然可为中华按蚊(Anopheles sinensis)幼虫取食。以含有大量固体悬浮颗粒及细菌、有机质的生活污水直接培养Anabaena sp. 7120,可为淡色库蚊(Culex pipien pallenns)幼虫有效取食,初步证明蓝藻在自然水中作为蚊幼虫食物的可能性。

基因工程灭蚊幼蓝藻的现场初步观察

将转入球形芽孢杆菌毒蛋白基因表达质粒的工程藻Ａｎａｂａｅｎａｓｕｂｔｒｏｐｉｃ（ｐＤＣ２６）大量培养后，应用于山东省平阴县进行现场观察。结果表明：工程藻在９．４１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ浓度以上时，４８ｈ可杀死９９～１００％蚊幼虫；在９．１３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ浓度时，４ｄ可杀死９９％以上蚊幼虫，连续观察２个多月，工程藻仍有明显杀蚊效果，实验组最多１４条／勺幼虫，而对照组２１０条／勺左右。观察还发现，工程藻对库蚊幼虫杀灭效果最好，其次为伊蚊，但高浓度时，对伊蚊仍有明显杀灭效果；由于按蚊幼虫密度太低，未能观察。此结果比单独使用球形芽孢杆菌杀灭蚊幼虫有明显提高，持续时间也延长，这将为蚊虫的持续控制提供一个新的有力武器。

五种微绿球藻产油和产多不饱和脂肪酸的研究

从5种微绿球藻中鉴别出4个高产油藻种和1个产油量很低的藻种。4种高产油微绿球藻在平台期油脂含量最高,占细胞干重的57%以上,其中三酰基甘油的含量占细胞干重的32.4%—45.2%。分析5种微绿球藻细胞的脂肪酸组成及4种高产油藻三酰基甘油中的脂肪酸组成,发现在高产油藻中,总的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的比例达到95%以上,多不饱和脂肪酸在5%以下,而在产油量很低的微绿球藻中多不饱和脂肪酸比例达45%以上。高产油微绿球藻三酰基甘油的多不饱和脂肪酸含量在4%以下,是生物柴油的优质原料,而产油量低的微绿球藻可用于提取C20:5脂肪酸(EPA)。

建立三种基因工程杀蚊幼蓝藻

基因工程杀蚊幼蓝藻的应用，为持续控制蚊幼虫的研究提供了新的途径。本文将携有球形芽孢杆菌晶体蛋白基因的ｐＤＣ２６穿梭质粒，通过接合转移导入多种鱼腥藻中进行表达。结果表明，所得到的基因工程藻Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．７１２０Ａｎａｂａｅｎａｃｙｌｉｄｒｉｃａ和Ａｎａｂａｅｎａｓｕｂｔｒｏｐｉｃ对淡色库蚊幼虫具有较高的毒效，２４ｈ半数致死浓度（ＬＣ５０）分别为：３．５１×１０４细胞／ｍｌ、３．３２×１０４细胞／ｍｌ和４．３４×１０４细胞／ｍｌ，其杂合质粒在蓝藻中有很高的稳定性，具备现场应用的要求。

基因工程杀蚊幼蓝藻的研究

应用基因工程手段研制杀蚊幼蓝藻,是解决苏云金杆菌和球形芽孢杆菌等短持效问题的途径之一。但国际上基因工程蓝藻的毒效一直限于较低水平,甚至需要破碎细胞才能检测到对蚊幼虫的毒杀作用。本文将球形芽孢杆菌毒素基因装配鱼腥藻启动子后,转移入鱼腥藻进行表达,所得基因工程株对蚊幼虫具有十分显著的毒效,对淡色库蚊幼虫24h半致死浓度为2.31×10~4细胞/ml;其对淡色库蚊、中华按蚊、白纹伊蚊幼虫的毒效依次递减,这与球形芽孢杆菌相似。由于鱼腥藻易培养、生态适应性广等,可望成为蚊虫特效控制的新型武器。

3种基因工程藻对中华按蚊幼虫杀灭作用的实验研究

本实验观察了３种基因工程杀蚊幼蓝藻对中华按蚊Ⅲ龄幼虫的杀灭作用。结果表明，当喷施工程藻浓度高于３．０×１０５ｃｅｌｓ／ｍｌ时，作用２４ｈ后，中华按蚊幼虫死亡数较低，而在４８ｈ、７２ｈ后蚊幼虫大部分（６７％以上）死亡；在喷施工程藻浓度低于３．０×１０４ｃｅｌｓ／ｍｌ时，２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的杀蚊幼效果均较差，此结果明显低于工程藻对淡色库蚊幼虫的作用效果。因此在应用基因工程藻进行现场控制蚊幼虫时，特别是在有较多按蚊幼虫的孳生地，应该考虑联合应用其它防治方法。

转基因蓝藻对不同龄期淡色库蚊幼虫杀灭作用的实验研究

目的：观察３种基因工程杀蚊幼蓝藻对不同龄期淡色库蚊幼虫的杀灭效果。方法：利用不同浓度基因工程藻，分别作用于不同龄期淡色库蚊幼虫，计算死亡率。结果：３种基因工程藻对不同龄期淡色库蚊幼虫杀灭作用相似；在藻细胞浓度低于１０４ｃｅｌｓ／ｍｌ时，杀灭作用由强到弱依次为Ⅰ龄、Ⅱ龄、Ⅲ龄末Ⅳ龄初幼虫；而当藻细胞浓度高于１０５ｃｅｌｓ／ｍｌ时，对该蚊不同龄期幼虫的杀灭作用均高效。结论：应用基因工程藻现场控制蚊幼虫宜尽早喷施，可提高杀灭效果。

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究 Ⅰ.球形芽孢杆菌毒蛋白基因42的克隆

为了提高球形芽孢杆菌对中华按蚊的毒效，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术成功扩增了Ｂ．ｓ．中有毒效作用的基因片段，通过Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰，使目的基因片段得以成功克隆。借助光敏生物素核酸标记探针，原位杂交筛选出目的基因阳性克隆。

球形芽孢杆菌两毒蛋白基因的分别克隆及杀蚊幼活性的协同作用

将球形芽孢杆菌两毒蛋白基因分别克隆并分别在大肠杆菌及鱼腥藻中表达，经对淡色库蚊幼虫毒性测试结果表明：只表达一种毒蛋白基因的大肠杆菌或鱼腥藻对蚊幼虫无毒效，而将分别表达这两种基因的大肠杆菌或鱼腥藻等浓度混合使用时则表现出高的杀蚊活性，从而证明球形芽孢杆菌两毒蛋白基因具有明显的协同作用，其杀蚊活性与同细胞表达两种毒蛋白基因的大肠杆菌或鱼腥藻相比，结果相似，无明显差异。

恶性疟原虫特异的质粒型DNA探针的制备

恶性疟原虫 DNA 与 pBR_(322)质粒 DNA 体外重组后,导入 E.coli HB_(101)建成基因文库,用疟原虫全基因组 DNA 从文库中筛出了5个杂交信号特强的克隆 pBF_1,pBF_2,pBF_3,pBF_4和 pBF_5。克隆 pBF_4 DNA与 P.c DNA,P.b DNA,及人白细胞 DNA 均无交叉反应,与 P.f DNA 杂交时,可检出的最低 DNA 量为10pg。

球形芽孢杆菌2362株杀蚊幼虫蛋白基因的克隆

利用合成的寡核苷酸探针从球形芽孢杆菌2362株基因文库中筛选了四个杂交阳性克隆,它们分别携带质粒 pDC4(7.8kb)、pDC5(7.8kb)、pDC6(8.4kb)和 pDC7(6.4kb)。斑点杂交结果显示,探针与pDC7结合能力明显比与 pDC4和 pDC6结合能力弱。四个杂合质粒 EcoRI 酶切图谱不同,但插入片段中都含有一个3.3kb 片段。Southern 印迹杂交实验进一步揭示该3.3kb 带可为探针识别;pDC24除此之外还有-1.4kb 杂交带,表明该质粒中携有两个与探针同源的序列。在以上四个克隆中,E.coli HB101(pDC4)对淡色库蚊幼虫有显著毒性,因而携有完整的基因51和基因42序列。

集胞藻ORFs侧翼序列的PCR扩增和定向基因插入失活策略

针对集胞藻ＰＣＣ６８０３的１９２７个待定编码基因进行了两侧序列的ＰＣＲ扩增。４个亚株基因组在。ｓｌｌ０２６７－ｓｌｌ０２６８－ｓｌｌ０２６９区域的 ＰＣＲ扩增产物与 Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ数据存在差异。以叶绿素合成基因ｃｈｌＨ和ｃｈｌＬ为例，显示三片段连接ＰＣＲ产物可有效用于集胞藻６８０３基因组定向插入失活。

中华按蚊幼虫肠壁膜泡的制备及其鼠抗血清对幼虫的作用

目的：搞清Ｂ．ｓ杀虫蛋白对蚊幼虫肠细胞膜的作用机理，从而改进杀虫蛋白活性。方法：差速离心制备肠细胞膜泡，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其蛋白组分；测试其鼠抗血清对蚊幼虫的效应。结果：膜制备物蛋白组分分析显示了膜泡的纯度，而抗血清则对Ⅰ龄幼虫有明显的致死效应；日龄越小，致死率越高。

中华按蚊幼虫肠细胞膜级分的制备及其鼠抗血清对幼虫的效应 (英文)

已知芽孢杆卤杀虫蛋白的毒效依赖于它们与幼虫肠细胞膜的亲合力。对于其机理的研究和应用蛋白质工程手段改造杀蚊蛋白来说,蚊幼虫肠细胞膜的制备是必不可少的。本研究收集了万余只中华按蚊幼虫肠道,用于分离其细胞膜级分,进行蛋白组分分析,鼠抗血清的制备以及该抗血清对幼虫的作用的观察。仅在一龄幼虫观察到致死效应。

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究Ⅱ.蚊幼虫肠壁细胞膜抗体基因的克隆

为了提高 Ｂ．ｓ．对蚊幼虫肠壁细胞膜的识别与结合力从而提高其杀蚊活性，本实验解剖了万余只中华按蚊幼虫肠道，制备了按蚊幼虫肠壁膜泡抗原及其鼠抗血清。抗原蛋白组分分析表明膜泡的纯度较高，而抗血清实验则显示出抗体组分与肠壁的结合作用。利用 Ｐ Ｃ Ｒ 技术成功扩增了小鼠抗体重链区基因，借助 Ｔ４ Ｄ Ｎ Ａ 聚合酶的修饰，使抗体基因得以成功克隆，为研制抗体基因与毒蛋白基因融合编码的“生物导弹”打下了基础。

三角褐指藻产油突变株的筛选

能源短缺和原油价格上涨是全球关注的问题之一,生物柴油作为一种优质的替代液体燃料越来越受到重视。以油料作物、废食用油和动物脂肪为原料生产生物柴油已远远不能满足需求。相比而言,产油微藻具有光合效率高、生物量大、油含量高、生长速率快、不受季节的限制及不占用耕地等优势,被认为是制备生物柴油燃料的更有潜力的原料。由于目前微藻生物柴油生产成本过高,尚未获得商业化生产。

适于沙漠地下水培养的耐碳酸氢钠产油微藻

能源危机是全世界面临的共同问题,采用可再生能源替代化石能源是出路之一。生物柴油作为一种清洁可再生能源备受瞩目[1—3]。目前,生物柴油主要以大豆和油菜、油棕和麻风树等油料植物以及动物油脂、废餐饮油等作为原料。但是动物油脂、废餐饮油原料有限,而油料植物生产油脂存在占地面积大、生产周期长等缺点,不宜作为未来生物柴油的主要来源。相比之下,产油微藻具有生长周期短、单位面积产量高等优点[4],

产蜡酯聚球藻PCC7002的构建

蜡酯是由含C16以上偶碳的高级脂肪酸与高级脂肪醇酯化形成的中性酯,是一种重要的经济油脂,被广泛应用于纺织、医药、化妆品和食品等行业。液态不饱和蜡酯还能作为航空航天工业、人工心脏、精密仪器仪表和特种机械等高科技领域专用的润滑剂。目前使用的蜡酯主要来源于动植物及矿石资源,来源十分有限,