Fibulin-3调控组织金属蛋白酶抑制因子-3影响椎间盘髓核细胞衰老的机制研究

目的探讨fibulin-3通过调控组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP-3)表达而影响椎间盘髓核细胞衰老的分子机制。方法(1)收集37例椎间盘术后患者的髓核组织及影像学资料,按照Pfirrmann分级评估椎间盘的退变程度,衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色法确定髓核细胞的衰老程度,Western blot和ELISA检测fibulin-3蛋白水平,探讨fibulin-3与椎间盘退变和髓核细胞衰老之间的关系;(2)体外培养人椎间盘髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs),观察连续传代过程中NPCs的增殖(CCK8法)和衰老(SA-β-gal染色法)情况,检测fibulin-3的表达水平以及促炎症因子和基质蛋白酶的表达情况。通过添加外源性fibulin-3验证其对NPCs增殖和衰老的影响;(3)通过基因过表达技术验证fibulin-3对NPCs凋亡和增殖的作用,结合凋亡抑制剂进行双向验证;(4)利用生物信息学分析fibulin-3与TIMP家族的关系,通过过表达fibulin-3并沉默TIMP-3基因的实验,验证其在NPCs衰老中的作用。结果(1)在37例患者的椎间盘退变样本中,按Pfirrmann分级,退变等级越高,fibulin-3的表达越低。Spearman相关性分析显示椎间盘分级与NPCs的衰老等级负相关(r=-0.87,P<0.001),与fibulin-3的表达量负相关(r=-0.79,P<0.001);(2)随着NPCs传代次数增加,fibulin-3的表达逐渐降低,细胞增殖能力减弱,促炎症因子和基质蛋白酶的表达增高。添加外源性fibulin-3后,细胞形态和生长状态得到保持,细胞衰老显著抑制,促炎症因子和基质蛋白酶的表达明显降低;(3)基因过表达实验显示,fibulin-3减少了NPCs的凋亡,促进了细胞增殖,从而抑制了NPCs的衰老;(4)生物信息学分析显示fibulin-3与TIMP家族的TIMP-3存在显著关联。进一步实验验证发现,过表达fibulin-3能够增强TIMP-3的表达,而沉默TIMP-3基因后,fibulin-3对NPCs衰老的抑制作用显著减弱。这表明fibulin-3通过调控TIMP-3来抑制基质金属蛋白酶活性,影响细胞外基质的合成和降解,最终抑制髓核细胞的衰老。结论本研究表明,fibulin-3通过调控TIMP-3在椎间盘髓核细胞衰老过程中发挥重要作用。具体机制包括:fibulin-3上调TIMP-3的表达,抑制基质金属蛋白酶活性,减少细胞外基质的降解,从而促进细胞外基质的合成;此外,fibulin-3通过减少细胞凋亡和促进细胞增殖,进一步抑制髓核细胞的衰老。因此,fibulin-3和TIMP-3在维持椎间盘健康和延缓退变过程中具有潜在的治疗意义。