转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性.结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为:log2N(拷贝数)=-0.9354△Ct+3.4116(R2=0.9974,P<0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85±1.77和18.87±1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1(1440bp)、TgInS2(1263bp)和TgInS3(1861bp)3个整合位点.以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性.采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子.初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础.

TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达

不完全的表观遗传重编程是造成转基因克隆动物效率低下的主要原因,组蛋白修饰作为表观遗传修饰的一个重要部分,可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达情况。TSA(Trichostatin A)作为一种组蛋白去乙酰化抑制剂,可以改变组蛋白的乙酰化水平,促进表观遗传重编程,提高克隆动物的效率。同时TSA能改变染色质结构,使转录因子易于与DNA序列结合,促进外源基因的表达。文章确定了TSA处理转基因猪成纤维细胞和核移植胚胎的最佳条件,分别为250 nmol/L、24 h和40 nmol/L、24 h,通过进一步正交实验发现,TSA同时处理供体细胞和克隆胚胎可以显著的促进核移植胚胎的体外发育。此外,无论TSA处理转基因猪成纤维细胞或核移植胚胎,都可以提高外源基因的表达水平。

外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性

转基因技术经过近半个世纪的发展,已成为当今生物技术研究的热点。近10多年来,与核移植技术的结合,转基因效率大大提高,携带有不同外源基因的不同种类的转基因动物迅速增加。但是,成功获得转基因动物并不是转基因动物研究的最终目的,如何利用转基因技术为人类的需求服务才是科研人员始终面对的课题。在畜牧生产领域,通过转基因技术培育家畜新品种是转基因技术应用的重要体现,在我国这方面已经引起了广泛关注。但迄今为止,外源基因在转基因动物中遗传和表达的稳定性仍然是亟待解决的问题,究其原因,这主要与位置效应、外源基因的表观遗传学修饰和遗传效率相关,文章结合目前的研究进展和本实验室的研究结果,从这3方面阐述其作用机制,期望为转基因动物遗传育种向产业化的迈进提供一定的理论探讨。

全细胞胞质内注射法生产猪重构胚的研究(简报)

自从1997年克隆羊“Dolly”出生以来。体细胞核移植技术得到广泛应用,已经有十余种克隆哺乳动物出生，但克隆效率仍然很低。核移植方法的不够完善是其重要原因之一。传统的核移植方法——电融合法和胞质内注射法虽然都取得了成功。但还存在操作复杂及需要辅助设备等问题。为了能够找出一种既容易操作，又不需要特殊设备的核移植方法，本研究对胞质内注射技术进行了改进,尝试了一种新的核移植方法——非Piezo辅助的全细胞胞质内注射法，即不通过Piezo辅助。不破坏供体细胞膜直接将供体细胞注入卵母细胞内，并且比较了这种方法与电融合法对猪体细胞核移植效率的影响。探讨了非Piezo辅助的全细胞胞质内注射法在猪体细胞核移植上的可行性。

小鼠早期胚胎发育过程中母源基因降解相关内源性小干扰RNA筛选与鉴定

为探究endo-siRNA在小鼠胚胎母源基因降解过程中的功能,通过生物信息学分析对小鼠母源基因和对应小RNA作筛选与鉴定,研究发现近三分之二母源基因为小RNA靶标。母源基因在早期胚胎发育过程中表达模式分析表明endo-siRNA与母源基因表达呈较强负相关,预示endo-siRNA在母源基因降解过程中具有重要功能。验证表明, endo-siRNA可在转录后水平调控母源mRNA水平,调控母源基因降解。研究结果为哺乳动物母胚转换的相关研究提供理论基础。

外源中心体在哺乳动物胚胎发育中的遗传机制

中心体是一个非膜包被的半保留细胞器,由一对相互垂直的圆柱形中心粒及其周围大量的高电子密度的蛋白质——中心体基质(pericentriolar material,PCM)组成。在所有哺乳动物细胞中,中心体(centrosome)作为主要的微管组织中心(microtubule organizing centers,MTOCs),起到组装和稳定微管的关键功能。在大多数哺乳动物精子形成过程中,精子保留了近端中心粒,失去了大部分的中心体旁蛋白和远端中心粒,而在卵母细胞形成过程中两个中心粒被逐渐降解,主要的中心体旁蛋白被保留了下来,弥散于卵胞质中。受精后,在卵母细胞中精子中心粒被进一步降解,来源于卵母细胞和精子的中心体旁蛋白形成受精卵的MTOCs在胚胎分裂过程中行使功能。但在小鼠等啮齿类动物精子形成过程中,两个中心粒全部被降解,因此受精卵中的MTOCs主要由来源于卵母细胞中心体旁蛋白组成。在大多数哺乳动物核移植胚胎中,外源中心粒在胚胎1-细胞期即被降解,而是来源于供体细胞和受体卵母细胞的中心体旁蛋白形成重构胚的MTOCs指导纺锤体形成,中心粒是在囊胚期才从头合成的。在灵长类中,来源于精子的中心粒能与PCM一起组成典型的中心体在胚胎分裂过程中行使功能,但在其核移植胚胎中,体细胞中心体和去核卵母细胞中剩余的中心体旁蛋白不能有效的组装形成功能性中心体,这可能是灵长类哺乳动物体细胞克隆失败的一个关键原因。

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。

应用双重PCR技术鉴定猪胎儿性别及其细胞系建立

sry和zfy/x是与哺乳动物性别决定有关的重要基因。本试验针对猪sry基因设计了两对PCR引物,以zfy/x为内参基因,利用双重PCR技术对6只30d左右猪胎儿的性别进行鉴定。结果表明,所有的6个样品都有447bp(雄性)或445bp(雌性)的zfy或zfx序列的扩增带,而采用两对不同的引物对sry序列扩增后,有1个样品出现241bp和166bp的扩增带为雄性,其余的无特异性扩增带为雌性,然后采用胶原酶消化培养法建立已知性别的猪胎儿成纤维细胞系。该方法具有简单、快速、准确的特点,为转基因克隆动物研究中尽早转染目的基因以及培养特定性别的胎儿成纤维细胞系提供了可靠的依据。

猪骨髓间充质干细胞的分离培养及核移植后重构胚胎发育能力的研究

不同类型的细胞核移植效率不同,原因之一可能是不同类型细胞核移植后进行重编程的潜力不同。本实验对猪骨髓间充质干细胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs)体外分离培养的方法进行了优化,对猪骨髓间充质干细胞的增殖及生长特性进行了观察分析,并以其作为供体细胞进行核移植,对此类型细胞进行重编程的潜力进行了评估。结果表明用密度梯度离心法分离猪骨髓间充质干细胞优于全骨髓贴壁法;猪骨髓间充质干细胞数目在培养第6天达到峰值,传代培养10h时,贴壁率达到78.50%;传代培养后第4天分裂指数最高,为24.00‰;以猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)和猪胎儿成纤维细胞(PF)分别作为供核细胞构建核移植胚胎,其体外囊胚发育率分别为14.63%与15.07%(P>0.05),孤雌对照组囊胚发育率为30.91%(P<0.05);而三组囊胚细胞数分别为30.67±17.7、24.1±6.5和25.8±11.4(P>0.05)。实验表明,体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛,生物学性状稳定,并适合作为核移植供体细胞。

精浆对猪精子冷冻效果影响的研究

为优化猪精子冷冻技术,提高解冻后精子的活力和受精能力,本试验分别以含精浆浓度为10%、20%和30%的冷冻保护剂处理精子,以冷冻前、解冻后精子活力和质膜完整性,解冻后精子进行体外受精(IVF)的卵裂率和囊胚率等作为检测指标,同时以含有卵黄的Tris-柠檬酸-葡萄糖(Tris-citric acid-glucose,TCG)冷冻基础液作为对照研究精浆对猪冷冻精子的保护作用。结果显示,在含有10%精浆浓度的稀释液中,冷冻前质膜完整性,解冻后精子活率、质膜完整性、IVF囊胚率相对于对照组均显著提高(P<0.05);当含有10%精浆的冷冻精液解冻后用于人工授精时,与配母猪妊娠率、窝产仔数、窝产活仔数等仍显著低于鲜精授精组(P<0.05)。上述结果表明,含10%精浆的冷冻保护剂能提高精子的冷冻后活力和IVF胚胎发育率,但用于人工授精配种与鲜精相比还有一定差距。

Iloprost对猪早期胚胎体外发育的影响

本研究旨在探讨PGI2类似物iloprost对猪胚胎体外发育的影响。试验以IVF胚胎为研究对象,分别在不同时期(0、24、48、72h)将不同浓度(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μmol.L-1)iloprost加入到猪胚胎培养液中,于156h时记录囊胚发育率和囊胚细胞数,筛选获得最佳添加方案,检测胚胎脂肪代谢速度和代谢相关基因(cox2、creb、pparδ、pdk、cpt2)的表达水平,分析iloprost影响胚胎发育的机制。结果显示,最佳的添加方案为,在受精后48h加入2.0μmol.L-1 iloprost,胚胎囊胚发育率(28%)和囊胚细胞数(49.42)显著高于(P<0.05)对照组的囊胚发育率(16%)和囊胚细胞数(28.22);添加iloprost后,胚胎脂肪酸降解速度也显著加快(P<0.05),脂肪酸代谢相关基因cox2、creb、pparδ、cpt2的表达量上升,糖代谢相关基因pdk表达量无显著变化。结果表明,PGI2类似物iloprost可以促进胚胎降解脂肪酸,为胚胎发育提供能量,提高了胚胎体外发育能力。

猪裸卵体外胞质成熟研究

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1 053.67)与COC组(1 426.00)和COC+GC组(1 541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P<0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P<0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著(P<0.05);成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P<0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。

猪源Lin28基因的克隆及其在猪胎儿成纤维细胞中的表达

Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子。根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列。将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28。在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts,PEF)。免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达。

猪裸卵体外胞质成熟研究(英文)

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1053.67)与COC组(1426.00)和COC+GC组(1541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P<0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P<0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%)(P<0.05),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著;成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P<0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。

猪不同直径卵泡内卵母细胞胞质成熟及体外发育潜力差异原因的初探

试验根据直径将猪卵泡分为2组：G1组（4~7mm）和G2组（2~4mm）,对2组卵泡内获取的卵母细胞体外成熟率和发育潜能进行了比较,利用相对定量PCR检测了卵丘细胞中卵丘扩展相关基因Has2、Ptgs2、Ptx31及Pgr的表达水平,应用绝对定量PCR检测了成熟培养前后卵母细胞线粒体拷贝数,并利用5,5′-二巯基-2-硝基苯酸（DTNB）酶循环法检测了体外成熟培养过程中卵母细胞谷胱甘肽（GSH）的含量。结果显示,G1组和G2组卵母细胞体外成熟率分别为95.06%和68.19%,G1和G2组排出第一极体的成熟卵母细胞孤雌激活后的囊胚率分别为51.47%和29.44%,2组卵母细胞在体外成熟率和孤雌发育率上均差异显著（P〈0.05）。G1组卵丘细胞在体外成熟培养过程中的扩展程度明显高于G2组,G1组卵母细胞对应的卵丘细胞扩展相关基因Has2、Ptgs2、Ptx31、Pgr的表达水平高于G2组（Has2基因在卵母细胞成熟培养0、24h除外）;G1组卵母细胞线粒体数、谷胱甘肽含量均高于G2组。以上结果表明,大卵泡来源的卵母细胞体外成熟能力和发育潜力优于小卵泡来源的卵母细胞,这可能与卵母细胞成熟过程中卵丘扩展程度、卵丘扩展相关基因表达激活情况、卵胞质内谷胱甘肽含量和线粒体拷贝数有关。

牛肌源性干细胞的培养和鉴定

探讨牛肌源性干细胞(MDSCs)的体外分离、培养、鉴定方法,旨在为牛体细胞核移植研究提供优质的供核细胞。使用胶原酶消化牛骨骼肌,然后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。在倒置显微镜下观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用结蛋白(Desmin)、CD34和CD45免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果显示,已成功地从牛骨骼肌中分离培养出具有干细胞特征的细胞,该细胞呈Desmin和CD34阳性、CD45阴性。因此,可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞。

精子介导的转基因效率关键影响因素

【目的】精子介导的转基因技术简单易行,其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同。但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低,转基因效率差异极大。现将主要探讨导致这种现象的原因。【方法】小鼠精子获能后分别与0、15、30和300nmol·L-1的Cy-3标记DNA(Cy-3-DNA)在37℃共孵育30 min。其后,血细胞计数板检测小鼠精子的活率;共孵育精子进行直接涂片,DPBS洗涤后涂片,DnaseI消化后涂片,精子涂片置于荧光显微镜下,记录视野中的精子总数及显示Cy-3信号的精子数,用于统计精子结合及内化DNA的效率。精子与300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后,以50μmol·L-1的P4诱导精子顶体反应,统计顶体反应前后显示Cy-3信号的精子比例。精子分别与15和300 nmol·L-1 Cy-3-DNA共孵育后,精子进行体外受精,在荧光镜下观察合子期受精卵中Cy-3-DNA的存在位置。按照优化后的条件,精子分别与0、15和300 nmol·L-1 pEGFP-C1质粒共孵育后进行体外受精,制备转基因胚胎。比较试验组和对照组的受精率和发育效率,采用PCR和RT-PCR方法检测囊胚期外源基因整合和表达情况。【结果】获能后的精子分别与0、3、15、30和300 nmol·L-1的Cy-3-DNA共孵育后,精子的活率分别为82.21%、73.63%、77.38%、76.33%和77.80%;洗涤前精子结合DNA的效率分别为76%、94%、99%和100%,15、30和300 nmol·L-1组精子结合率均显著高于3 nmol·L-1组(P<0.05)。洗涤后精子结合DNA的效率,分别为45%、66%、84%和87%,消化后精子内化DNA的效率分别为44%、56%、71%和76%,并且洗涤后精子结合及消化后精子内化DNA的效率都为300 nmol·L-1组和30 nmol·L-1组均显著高于其他两组,而15 nmol·L-1组显著高于3 nmol·L-1组(P<0.05);Image J对精子结合Cy-3-DNA的强度进行分析的结果表明,外源DNA的量随着外源DNA浓度的增加而显著增加(P<0.01)。顶体反应后,精子顶体部DNA会有丢失,但精子头部后区的外源DNA依然会保留,因此,顶体反应前后,精子结合外源DNA的精子比率没有降低。15和300 nmol·L-1 DNA共孵育的精子体外受精后,荧光显微镜下检测显示,合子期胚胎有外源DNA的荧光信号分布,将荧光信号在雄原核附近密集的胚胎记为阳性胚胎,300 nmol·L-1 DNA共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为27.89%,显著高于15nmol·L-1组的9.00%(P<0.05)。精子与pEGFP-C1质粒共孵育后,体外受精,结果表明精子与DNA共孵育后,卵母细胞受精率及胚胎卵发育率与对照组相比差异不显著。单囊胚PCR检测15和300 nmol·L-1的pEGFP-C1质粒与精子共孵育转基因胚胎阳性率分别为8.72%和21.50%;采用RT-PCR方法在300 nmol·L-1组的囊胚中检测到了EGFP基因RNA的表达,在荧光显微镜下没有观察到EGFP绿色荧光蛋白的表达。【结论】精子具备结合和内化外源DNA的能力,并能将外源DNA带入卵母细胞,顶体反应会使精子丢失顶体部DNA,但精子头部后区外源DNA依然保留。受精过程外源DNA在基因组中的整合及外源基因表达激活是精子介导转基因效率的关键影响因素。

猪胚胎体外培养体系优化对胚胎干细胞建系的影响

为提高体外胚胎发育质量和体外胚胎建立胚胎干细胞系效率,研究以N2B27为基础的干细胞培养体系对猪孤雌胚胎体外发育和后续建立胚胎干细胞系的影响。设立3个试验组:PZM-3组,孤雌激活的胚胎全程PZM-3培养体系中培养;N2B27组,孤雌激活的胚胎全程N2B27培养体系中培养;PZM-3-N2B27组,孤雌胚胎在PZM-3培养体系中培养至桑葚胚后更换为N2B27培养体系。结果表明,N2B27组无法获得囊胚,但PZM-3-N2B27组胚胎可正常发育至囊胚,囊胚率未显著提高,但囊胚细胞总数显著提高(P<0.05)。PZM-3-N2B27组获得孤雌囊胚用于建立猪胚胎干细胞系,显著提高原代克隆形成率(P<0.05),获得猪胚胎干细胞系呈碱性磷酸酶阳性,表达Oct4、Sox2和Nanog等多能性基因。结果表明,采用PZM-3和N2B27培养体系结合获得的猪孤雌囊胚利于猪胚胎干细胞系建立。研究为进一步优化猪胚胎体外培养体系,获得初始态胚胎干细胞系提供参考。

碱性体系中添加剂对铝阳极电化学性能的影响

为了提高碱性电池中铝阳极的活化性能、降低其析氢腐蚀,用析氢速率、开路电压测试和塔菲尔曲线、交流阻抗方法,系统的研究了多种添加剂对铝阳极的电化学性能的影响。结果表明:KCl、MnCl2、K2MnO4、Na2WO3、NH2CH2COOH对铝阳极的开路电位负移和抑制析氢均有良好的效果。复配添加剂K2MnO4+KCl和ZnO+KCl分别对铝阳极具有显著的活化作用,并且对抑制析氢有明显的作用。

铝合金在碱性和中性溶液中电化学行为的研究

通过对铝阳极进行交流阻抗、塔菲尔曲线、析氢速率、开路电压测试,研究了多种铝合金在碱性和中性溶液中的电化学行为。发现Al-Ga-Sn-Mg和Al-Ga-Sn-Zn具有较好的电化学性能。与纯铝相比,在碱性电解液中,Al-Ga-Sn-Mg的开路电位负移70mV,抑制析氢速率为37.5%;在中性电解液中,Al-Ga-Sn-Mg合金的开路电位负移447mV。铝阳极在碱性和中性溶液中的反应机理不同。