动物细胞培养技术研究进展

动物细胞培养是生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法,可分为原代和传代培养,有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式.细胞生长具有特殊的生物学性质,需要无菌、恒温和充分的营养环境.动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战.

小鼠B7-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的：构建介导小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒载体,研究其对L929细胞表面B7-1分子表达的沉默效应。方法：从小鼠B7-1基因编码区选择3段RNA干扰靶序列,制备转录双发夹RNA的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1的RNAi慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T细胞GFP表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒稳定感染的L929细胞,流式细胞术分析细胞中GFP及B7-1分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T细胞混合培养,分析B7-1稳定沉默细胞刺激T细胞增殖的能力。结果：成功了构建小鼠B7-1基因RNA干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达（3~5）×10~8TU/ml的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929细胞介导GFP表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T细胞增殖的能力显著下降（P〈0.05）。结论：构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929细胞表面B7-1分子表达,抑制B7-1/CD28信号诱导的T细胞增殖效应。

Pristane诱导的系统性红斑狼疮小鼠模型的研究进展

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是由于机体免疫功能紊乱而导致的自身免疫性疾病（[1]）。在SLE患者的体内,细胞异常凋亡,细胞因子分泌失衡,T、B细胞过度活化,产生大量的自身抗体以及造成免疫复合物（Immune complex,IC）沉积,最终累及全身多器官系统造成损害（[2-7]）。虽然确切病因和发病机制仍不明确（[8]）,但一般认为SLE可由多种因素综合作用而诱发,其中环境因素在SLE的发病过程中具有重要的作用。

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应

目的:在运用化学法建立小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上,探讨B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/D28信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法:取6周龄雌性C57BL/6J小鼠,予一次性腹腔注射Pristane 0.5ml/只,每月定期检测小鼠的尿蛋白、ANA及肾脏病理学改变。取尿蛋白含量达到++,ANA荧光强度达到++的小鼠随机分为3组,每组5只。抗体干预组用B7-1人-鼠嵌合抗体经眼眶静脉序贯给药,阳性对照组注射免疫抑制剂CTX,阴性对照组注射人同型Ig G。每月定期检测尿蛋白及ANA,干预至3个月时,处死小鼠,取肾脏进行H&E染色分析,免疫复合物(IC)检测及透射电镜观察。结果:Pristane诱导至4个月时,80%的小鼠尿蛋白含量达到+^+++,血清ANA荧光强度为++^+++,出现尿蛋白及ANA的小鼠,其肾小球炎性细胞侵润,肾小管上皮样细胞可见水肿样变性、血管充血明显,纤维组织增生。抗体干预后,尿蛋白逐渐由++^+++降为±^++,ANA由++^+++降为+^++。与阴性对照组比较具有统计学差异(P<0.01)。肾脏HE染色分析的结果显示,抗体干预组肾小球炎性细胞侵润及肾小管充血等表现均得到明显改善。免疫荧光染色可见抗体干预组抗原抗体复合物(IC)的荧光强度明显减弱。经透射电镜观察,抗体干预组与阴性对照组相比,肾小球的电子致密物沉积减少,基底膜厚度趋于均匀。结论:B7-1抗体通过抑制B7-1/CD28信号通路下调机体的免疫应答,减少自身抗体的产生,对自身免疫造成的病理损伤具有逆转作用。

2种腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白对人成纤维细胞转染效率的研究

目的比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast,HFB)的转染效率。方法原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of in-fection,MOI)为104、105、106转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的转染效率,倒置荧光显微镜观察转染后的荧光强度。MTT法检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的毒性。结果腺相关病毒AAV2-EGFP对HFB的转染效率随着MOI增加而增高,MOI为104时转染效率为(7.68±1.18)%,当MOI达到105后,转染效率稳定在(22.16±5.59)%,随着MOI增加,最高至MOI 106转染效率无显著提高。而病毒AAV2/1对于HFB的转染效率在MOI为106转染效率仅为(3.47±0.93)%。2种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异。结论AAV2载体对体外培养的HFB转染效率高于AAV2/1,但2种病毒载体对人皮肤成纤维细胞转染效率均不高,AAV2/1-EGFP对HFB几乎无感染能力。

抗人CD80单链抗体对不同肿瘤细胞膜型CD80分子的识别与体外增殖的影响

目的:制备真核细胞CHO表达的CD80单链抗体(CD80-scFv)并研究其对不同肿瘤细胞膜型分子的识别及增殖的影响。方法:将表达CD80-scFv的CHO细胞大规模无血清培养收集上清,采用IMAC亲和层析法纯化获取抗人抗体。采用免疫荧光及流式细胞术分析其对人恶性B系淋巴瘤细胞株Daudi、人黑色素瘤细胞株A375、神经胶质瘤细胞株U251及人多发性骨髓瘤细胞株8266及U266细胞膜型CD80分子的识别。在上述肿瘤细胞的培养体系中加入不同浓度的CD80-scFv,MTT法分析其对肿瘤细胞增殖的影响。以天然高表达CD80分子的8266细胞经丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC作为效应细胞,分析抗体通过阻断共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:从CHO细胞培养上清中获取的抗人CD80-scFv纯化品的量为6.67 mg/L;该抗体与Daudi、U251、A375、8266及U266的阳性结合率分别为96.8%、39.6%、20.5%、99.9%及3.8%。抗体对高表达CD80分子的Daudi及8266细胞具有增殖抑制作用,加入抗体(终浓度为25μg/mL)培养72 h时的抑制率分别为24.04%及24.16%。同时,抗体通过阻断CD80-CD28介导的共刺激信号,抑制PBMC的增殖。结论:CD80-scFv能够特异识别细胞膜型CD80分子,并对高表达细胞的体外增殖具有抑制作用。

涤纶用耐久阻燃剂的合成及应用

用两步法合成了涤纶耐久阻燃整理剂TFP,并将其用于涤纶织物的阻燃整理.分别研究了阻燃剂用量、工作液pH以及整理后水洗次数对织物性能的影响.结果发现:当阻燃剂用量为120 g/L,工作液pH值为6.5时,织物具有良好的阻燃效果(达到国标B1级)和优异的耐水洗性能(可耐50次以上水洗),且不影响织物的色泽和手感.

抗人CD86单链抗体的基因克隆、表达及结合活性分析

目的构建并在CHO细胞中表达抗人CD86单链抗体(CD86-scFv),研究该抗体与抗原的结合特性及介导的生物学功能。方法从分泌鼠源CD86抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL基因,构建含有前导肽L-VH-Linker-VL抗体编码基因的表达载体并转染CHO细胞。经筛选高分泌株并扩大培养后收集上清进行纯化。流式细胞术分析CD86-scFv对不同细胞膜型CD86分子的识别及与鼠源亲本抗体1D1的竞争抑制效应。MTT法分析CD86-scFv与Raji细胞表达的CD86结合后对细胞生长的影响。结果获得了稳定表达抗人CD86-scFv的CHO细胞株及相应抗体。CD86-scFv与CD86基因转染细胞株L929-CD86、天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi细胞的阳性结合率分别为67.0%、72.3%和80.5%。CD86-scFv对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力,将CD86-scFv(终浓度20μg/mL)加入Raji细胞共同培养72 h时的细胞生长抑制率为28.3%。结论成功构建了稳定分泌抗人CD86-scFv的CHO细胞株(命名为SA-IV)。该抗体能够识别CD86分子并具有良好的生物学活性。

2种腺病毒介导的eGFP对人成纤维细胞转染效率的研究

目的:比较2种不同腺病毒(adenovirus,AD)介导的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)对人皮肤成纤维细胞(Human Fibroblast,HFB)的转染效率。方法:原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数MOI为10、25、50、100转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AD5-EGFP和AD5/F35-EGFP对HFB的转染效率,荧光显微镜观察转染后的荧光强度。MTT法检测AD5-EGFP和AD5/F35-EGFP对HFB的毒性。结果:两种腺病毒对HFB的转染效率随着MOI增加而增高。AD5-EGFP和AD5/F35-EGFP在MOI为10、25、50、100时转染效率分别为9.44+3.44%、31.96+11.19%、51.7+7.24%、69.99+3.26%和22.82+8.98%、55.08+2.19%、63.37+7.24%、88.63+2.58%。两种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异。结论:AD5/F35载体对HFB嗜性显著高于AD5。在皮肤组织的基因修饰中,AD5/F35比AD5更具优越性。

抗人B7-1及B7-2双特异性抗体的构建、表达及与抗原结合的特性分析

目的:构建及表达抗人B7-1及B7-2双特异性抗体(anti-B7-1/B7-2-Bs Ab),并分析其与相应抗原结合的特性。方法:采用PCR的方法分别从重组质粒中克隆出抗人B7-1及B7-2单链抗体基因,将其克隆入p IRES2-EGFP表达载体,并用6×His为纯化的标签。用脂质体法将两个基因转染入中华仓鼠卵巢细胞(CHO),经G418加压筛选高表达株,扩大培养并收集上清纯化。分析抗体对膜型B7-1及B7-2的识别及与其相应抗原的结合能力。以天然高表达B7-1及B7-2分子的Raji细胞用丝裂霉素处理后作为APC,人PBMC为效应细胞,分析抗体通过阻断B7-CD28共刺激信号对PBMC增殖的影响。结果:获得了稳定表达抗人B7-1/B7-2-Bs Ab的CHO细胞株及相应的抗体。该抗体与B7-1及B7-2基因转染细胞株L929-B7-1及L929-B7-2的阳性结合率分别为99.5%及62.0%。Anti-B7-1/B7-2-Bs Ab对抗人B7-1及B7-2单链抗体的竞争结合率分别为0.4%及32.4%。Anti-B7-1/B7-2-Bs Ab通过阻断B7-CD28共刺激信号使PBMC的增殖效应仅为阴性对照组的59.7%。结论:成功构建了稳定分泌抗人B7-1/B7-2-Bs Ab的CHO细胞株(命名为SA-VI)。该抗体可以识别B7-1及B7-2分子并具有良好的生物学活性。

CXC趋化因子受体3的单克隆抗体抑制体外培养的MCF-7细胞和HepG2细胞的增殖及迁移

目的研究CXC趋化因子受体3(CXCR3)单克隆抗体(mAb)对MCF-7人乳腺癌细胞和HepG2人肝癌细胞体外增殖及迁移的影响。方法诱生腹水法制备CXCR3 m Ab;流式细胞术筛选高表达CXCR3的MCF-7细胞和HepG2细胞;MTT法检测CXCR3 mAb对MCF-7细胞和HepG2细胞增殖及干扰素诱导的T细胞α趋化因子(I-TAC)对MCF-7细胞和HepG2细胞促增殖的影响;TranswellTM法研究CXCR3 mAb对MCF-7细胞和HepG2细胞迁移及I-TAC对MCF-7细胞和HepG2细胞促迁移的影响。结果 MCF-7细胞和HepG2细胞CXCR3的阳性表达率分别为83.5%和96.2%;50μg/m L CXCR3 m Ab能够显著的抑制MCF-7细胞和HepG2细胞的增殖并抑制I-TAC对MCF-7细胞和HepG2细胞的促增殖作用;50μg/m L CXCR3 m Ab可抑制MCF-7细胞和HepG2细胞的迁移,并抑制I-TAC对MCF-7细胞和HepG2细胞促迁移作用。结论 CXCR3 mAb能够显著地抑制高表达CXCR3的肿瘤细胞的增殖及迁移。

D-半乳糖所致衰老小鼠抗原提呈细胞的改变及其意义

目的:研究D-半乳糖所致衰老小鼠专职性抗原提呈细胞的改变及其意义。方法:取健康昆明雌性小鼠,2月龄,运用D-半乳糖建立衰老小鼠模型并进行生物学鉴定后,采用免疫荧光和流式细胞术测定脾脏中巨噬细胞CD11b、树突状细胞CD11c、B淋巴细胞CD40的表达;采用免疫组化法测定脾脏组织Fas表达的改变。结果:模型组小鼠巨噬细胞CD11b+/MHC-Ⅱ+CD11b+的百分率为9.78±1.42,与对照组10.76±1.93相比下降(P<0.05);模型组小鼠树突状细胞CD11c+/MHC-Ⅱ+CD11c+、B淋巴细胞CD40+的百分率分别为5.34±0.74、43.60±8.06,与对照组7.88±1.73、56.70±10.97相比明显下降(P<0.01)。模型组小鼠脾脏组织Fas表达增加。结论:D-半乳糖所致衰老小鼠脾脏各种专职性抗原提呈细胞减少,脾脏组织Fas的表达出现渐进性增加。

抗人CD86双价抗体的表达及与抗原的结合特性

目的:用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达抗人CD86双价抗体(CD86-diabody),鉴定该抗体对表达CD86分子肿瘤细胞的识别及介导的生物学效应。方法:从分泌抗人CD86小鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL。SOE-PCR构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因,整合到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染CHO细胞,FCM筛选G418加压培养的阳性克隆。IMAC纯化并定量抗体。免疫荧光法分析抗体对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率,将抗体加入到Raji细胞的培养体系中,培养72 h,MTT法分析抗体对细胞体外增殖的影响。结果:获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株。培养上清中抗体纯品的得率为5.24 mg/L。抗体与Raji及Daudi细胞的阳性结合率分别为77.2%及70.6%。经抗体孵育72 h,Raji细胞体外增殖抑制率为37%。结论:成功制备了抗人CD86-diabody,可特异性结合细胞膜型CD86分子,并对表达该分子的肿瘤细胞体外增殖具有抑制效应。

致敏原剂量对哮喘模型免疫细胞活化及肺组织损伤的影响

目的研究致敏原的剂量对哮喘模型免疫细胞活化及肺组织损伤的影响。方法以卵蛋白为致敏原,采用腹腔注射[高剂量组1 mg/(只·次),低剂量组0.1 mg/(只·次)]联合雾化吸入建立小鼠哮喘模型。ELISA分析血液中过敏相关免疫球蛋白IgE及细胞因子IL-4与IFN-γ的水平,免疫荧光及流式细胞术分析脾脏免疫细胞(包括T、B和DC细胞)的活化程度,HE染色分析肺组织的损伤情况。结果模型组小鼠血液中IgE及IL-4的水平明显高于对照组(P<0.05),且高剂量组高于低剂量组(P<0.05)。但IFN-γ的水平模型组均低于对照组(P<0.05),高、低剂量组间无差异(P>0.05)。模型组小鼠脾脏细胞膜型CD28、CD86、CD80、CD40和MHC-Ⅱ的表达均高于对照组(P<0.05),且高剂量组高于低剂量组(P<0.05)。显微镜下观察模型组小鼠肺组织出现炎性细胞浸润及支气管壁增厚等病理改变,高剂量组更为严重。结论哮喘引发的免疫细胞活化和肺组织病理损伤与致敏原的剂量呈正相关。

预分解窑结球原因浅析

安徽矿业集团公司2500t/d新型干法水泥熟料生产线,自2004年7月点火试产,窑内频繁结球是比较突出的问题.从2004年9月～2005年元月中旬,多次因结球造成产品质量不稳定,甚至被迫停窑处理,给安全生产带来了很大的影响.针对该线的实际,通过原因分析,提出了相应的措施及预防手段,自2005年春节以来,结球问题基本解决.

比较两种途径釆血对比色法测定水杨酸钠血浆半衰期的影响

目的:观察心脏釆血和颈总动脉釆血对比色法测定家兔水杨酸钠血浆半衰期的影响。方法:将12只家兔(雌雄不限)分为心脏釆血组和颈总动脉釆血组,经耳缘静脉注射10%水杨酸钠溶液(2ml·kg-1),分别于给药前、给药后10min和40min釆血,处理血样,分光光度计在510nm下测定血浆水杨酸的光密度值,计算其半衰期。结果:心脏釆血组家兔10%水杨酸钠溶液的半衰期比颈总动脉釆血组明显延长(P<0.05),颈总动脉釆血组家兔的实验数据较心脏釆血组更为稳定。结论:颈总动脉釆血法较心脏釆血法对水杨酸钠半衰期的测定更为稳定。

《中州全韵》的成书年代及其成书价值考论

近几十年来,音韵学的研究发展迅速,取得丰硕的成果。近年来,明清语音的研究也取得很大的发展。《中州全韵》是一部北曲性质的韵书,成书年代经考证为明崇祯四年(公元1631年),深入研究,发现其对明清韵书的体例及内容产生了非常重要的影响。

预热器堵料原因分析、预防及处理

预热器堵料是每个生产厂家都要面对而又倍感头疼的问题,清理起来费力费时,而且在清理过程中如果操作保护不当还会造成安全事故。2006年我公司两条2500t/d五级双系列预分解窑（TDF分解炉）共发生9起预热器堵料事故,其中有8起发生在上半年,下半年仅11月9日因一线尾排风机跳停而堵料一次,下半年我公司预热器防堵工作之所以做得好,是和前几起事故的分析、总结并采取切实有效的措施分不开的。

《中州全韵》声调探析

《中州全韵》是范善溱所作一部北曲性质的韵书,是关于近代汉语语音的重要著作。其中去分阴阳为本书最大特色,在很大程度上反映了当时的实际语音状况。

鼠抗人CD28单克隆抗体的制备及体外生物学活性的初步研究

目的:制备纯化的鼠抗人CD28分子的单克隆抗体,初步研究其体外生物学活性。方法:采用诱生腹水法制备抗体,ProteinA免疫亲和层析法进行纯化,并对纯化的抗体进行SEC-HPLC分析测定其纯度;ELISA及流式细胞术检测抗体与重组CD28抗原及Jurkat膜表达CD28的结合活性,表面等离子体共振技术检测抗体与CD28的结合动力学参数,并研究抗体对外周血T细胞增殖的影响。结果:制备获得纯化的鼠抗人CD28分子的单克隆抗体,其纯度>95%,能够结合重组及天然表达的CD28,其半数效应浓度(EC50)分别为19.8μg/ml和15.2μg/ml,该抗体与CD28结合亲和力常数(KD)为2.13×10^-9M。基于细胞的活性分析结果表明,该抗体具有明显的促进人外周血T细胞增殖的活性。结论:本研究制备获得纯化的鼠抗人CD28单克隆抗体,该抗体具有良好的识别CD28的特性以及促进外周血T细胞增殖的活性。