CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线(T)和质控线(C)。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。

鱼类细胞系研究现状

鱼类细胞系是研究鱼类病毒学、生理学、毒理学、免疫学和分子遗传学的重要材料和重要的体外研究系统。鱼类细胞系的组织来源包括脑、心脏、鳃、肾脏、鳍条和卵巢等各种组织。目前已至少建立并应用了826株鱼类细胞系。本文综述了近年来鱼类细胞系的组织来源、培养方法及应用现状,旨在为鱼类细胞系研究提供最新的数据支撑。

鲤鱼双线绦虫裂头蚴的分子鉴定和系统发育关系分析

为了鉴定天津市某养殖场鲤鱼腹腔内寄生的“面条样”虫体,本试验通过PCR方法扩增虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列,并进行分子鉴定和基因测序,分析3种基因的同源性、分子进化和系统发育关系。结果显示,寄生于鲤鱼体内的虫体的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列分别与双线绦虫分离株MN204040.1(中国)、MN219466.1(中国)和EU241209.1(法国)的核苷酸序列同源性较高,为99.45%、98.74%和99.26%。基于18S rRNA、COⅠ和COB基因序列构建的系统发育树显示,本试验分离的绦虫裂头蚴与GenBank数据库中已鉴定的双线绦虫聚在同一分支上,且与双线绦虫中国武汉分离株的种属亲缘关系较近。本试验初步阐明获得的天津市双线绦虫分离株与其他种属之间的系统发育关系,为双线绦虫的分子鉴定和系统发育关系分析提供了数据支持。

饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分三重TaqMan-MGB荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分的广谱、快速检测方法,收集Genbank中鳕鱼、鲈鱼、沙丁鱼等鱼类,猪、牛、羊等哺乳类以及鸡、鸭、鹅等禽类的18S rRNA基因序列,分别设计特异性扩增引物和MGB-TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标物种类型而与其他物种无交叉反应。3套引物探针体系组合后可同时检测鱼类、哺乳类及禽类源性成分,三重荧光PCR方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的三重荧光PCR方法检测35份进境及国产饲料样本,从2份进口饲料及1份国产饲料中检出非标定动物源性成分,结果与行业标准方法的检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为包括饲料在内的动物产制品源性成分定性分析提供了新的技术分析手段。

常见布尼亚病毒病诊断研究进展

布尼亚病毒目下属多个病毒科(属)的病毒对人和动物具有烈性感染致病能力或潜在的感染致病风险。本文以常见的感染动物和人兽共患的布尼亚病毒为重点,介绍了卡奇谷病、赤羽病、施马伦贝格病、绵羊内罗毕病、克里米亚-刚果出血热和裂谷热的临床诊断和实验室检测方法,对布尼亚病毒感染引起的市场生物安全防控工作具有重要意义。

布鲁氏菌病快速检测试纸条的探索

目的建立一种操作简单、结果肉眼可视,并具有良好敏感性和特异性的适合现场快速检测布鲁氏菌病的胶体金层析方法。方法将重组的布鲁氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28作为胶体金标记物,抗OMP22单克隆抗体作为质控线,OMP22和OMP28蛋白作为检测线组装试纸条。结果该试纸条检测牛布鲁氏菌标准阳性血清最大稀释度可达1∶128;并且与牛结核、蓝舌病、牛病毒性腹泻、口蹄疫、牛白血病及小反刍兽疫血清无交叉反应;检测牛、羊源血清样品结果与商品化的ELISA检测试剂盒(IDEXX)符合率为95%,与虎红平板凝集试验(RBPT)检测的符合率为97.4%。结论胶体金层析试纸条在检测布鲁氏菌病方面具有快速、敏感性高及特异性强的特点,适用于布鲁氏菌病动态流行病学调查和临床快速筛查。

胶体金免疫层析技术在食源性致病微生物检测中的应用

随着人们生活水平的提高,肉、蛋、奶类在人们日常餐桌上出现的数量猛增。因此,动物食品安全问题成为我国市场监督管理部门关注的重点。很多家畜因感染某些疾病,致使肉、蛋、奶中带入传染源,此类疾病传染性强,危害大,严重威胁人类健康。因此,早期快速检测对预防控制此类疾病的发生发展具有重大意义。

A型流感病毒分型基因芯片在流感病毒各亚型监测中的应用

为验证自行研制的A型流感病毒分型基因芯片方法在实际中的应用效果,了解A型流感病毒各亚型在我国不同地区和不同宿主中的分布情况,对我国20个地区、不同宿主源(鸡、鸭、鹌鹑、鸽子、猪、人等)拭子和组织样品共16 852份进行了检测。利用自行研制的A型流感病毒分型基因芯片方法,对样品进行RNA提取、多重不对称RT-PCR扩增、芯片杂交、洗涤和扫描分析;同时将基因芯片检测阳性的样品,用普通RT-PCR扩增后进行序列测定。结果显示:利用该方法检出阳性样品2 582份,总检出率为15.32%(2 582/16 852),共检测到H1N1、H2N9、H3N2、H4N6、H5N1、H7N1、H7N9、H9N2、H10N5、H16N3等10个亚型,且均与阳性样品测序结果一致。结果表明,该方法可准确检测不同地区、不同宿主中的A型流感病毒不同亚型。同时,该方法能在同一张芯片上准确鉴定A型流感病毒的多种亚型,解决了其他常规方法无法检测已发现和可能发生变异的所有亚型的棘手问题,从而为A型流感诊断和分子流行病学监测提供了一种新技术。

蓝舌病毒抗体量子点检测试纸条的研制

为建立一种快速检测蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过量子点标记葡萄球菌A蛋白(SPA),以蓝舌病病毒VP7蛋白作为检测线,抗葡萄球菌A蛋白单克隆抗体作为质控线组装量子点免疫层析试纸条。结果显示,该量子点试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶256时仍可检出;试纸条阳性阈值为0.0668,并且根据阈值确定了试纸条检测蓝舌病抗体最低含量为0.25 ng/mL;该试纸条与结核病、布鲁氏菌病、病毒性腹泻、巴氏杆菌病、小反刍兽疫及地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为96.9%(63/65)。结果表明,量子点免疫层析试纸条在检测蓝舌病方面具有快速、灵敏度高、特异性强的优势,适用于蓝舌病的流行病学调查和临床快速筛查。

纳米佐剂疫苗的特点与应用

纳米材料具有特殊的物理和化学性质,在各个领域的应用日益广泛。因其具有良好的生物相容性、生物靶向作用和较高的生物利用度,可将其作为疫苗佐剂的载体。纳米材料能快速有效地靶向于特定部位,提高新型疫苗的免疫原性,避免在肝脏内的首关消除作用,降低其毒副作用。纳米疫苗在预防和治疗疾病方面有广阔的发展前景。

纳米医学技术在妇产科疾病诊疗方面的应用

纳米医学技术是一门新兴的科学技术，为许多疾病的诊治提供了全新的思路。因纳米材料具有独特的物理、化学性质和较好的生物相客性被广泛应用于妇产科疾病的早期诊断、靶向及联合治疗中。产前诊断凭借纳米医学技术的早期、快速及高效检测的特点不仅降低了新生儿患遗传病率，而且保障了孕妇的健康；纳米技术靶向性、稳定性及高效性的特点为妇科疾病的诊疗带来了新希望。本文就纳米技术在妇产科疾病诊疗中的优点、应用前景进行综述和展望。

广州管圆线虫病现代诊断技术的进展

2004年卫生部将广州管圆线虫病列为一种新发的食源性传染病，近年来陆续出现由生食或半生食被感染期幼虫感染过的蔬菜、褐云玛瑙螺、福寿螺、鱼、虾、蟹等造成广州管圆线虫病暴发的报道。该病主要侵犯人体的中枢神经系统，而病原学检测敏感性极低，因此如何诊断该病成为临床亟待解决的一大技术难题。本文就以广州管圆线虫病现代诊断技术进行综述和展望。

血吸虫病现代诊断技术的研究现状

血吸虫病是一种严重危害人畜健康的寄生虫病。传统的血吸虫病诊断技术主要包括病原学检查,免疫学检查和影像学检查3个方面。近年来随着新型生物材料、分子生物学和生物传感器等新技术的发展,也给血吸虫病的检测和诊断技术带来了新的方法。

猴痘病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高、操作简单的猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)检测方法,试验针对MPXV保守区OPG002基因片段设计特异性引物,通过优化环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,并应用该方法检测了临床样品和模拟样品。结果表明:建立的MPXV实时荧光LAMP检测方法于64℃恒温反应60 min即可完成DNA检测;该方法能特异性地检出MPXV,最低检出限为25 copies/μL,灵敏度是普通PCR方法的20倍;该方法对12份临床样品的检测结果均为阴性,可检测出质粒浓度为0.5×10~2~0.5×10~6 copies/μL的模拟阳性样品。说明建立的MPXV荧光LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点,可用于MPXV的快速鉴别诊断。

猴痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速诊断猴痘病毒(MPXV)的检测方法,根据2022年公布的MPXV的靶基因片段F3L(462 bp,GenBank登录号ON563414)保守区域,设计了1对特异性的引物和1条探针,建立了猴痘病毒荧光定量PCR检测方法。结果显示,本方法仅能有效检测MPXV,与天花病毒、牛痘病毒、痘苗病毒及鼠痘病毒均无交叉反应;对重组质粒标准品的最低检测限为36.5 copies/μL;组内与组间的重复试验变异系数均小于2%;该方法与中国计量科学研究院使用的绝对定量数字PCR方法检测F3L假病毒颗粒的结果一致性达100%。由此表明,本研究中建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性和实用性好,可以用于猴痘病毒的快速鉴别诊断,为口岸进境动物和入境人员的筛查提供了有效的技术手段。

牛结节性皮肤病病毒LAMP快检方法的建立与应用

本研究旨在建立一种特异性检测牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的LAMP快检方法,以用于该病临床早期诊断与监测。笔者根据LSDV的特异性基因序列,设计了数十套LAMP引物,经过筛选最终确定1套反应效率最高的引物,其位于LSDV095基因序列内。以实验室保存的PUC57-LSDV质粒作为阳性质控进行方法的优化与验证,基于不同的检测需求,分别建立了实时浊度LAMP检测方法、实时荧光LAMP检测方法及荧光可视化LAMP检测方法。优化后的3种LSDV LAMP方法灵敏度均可达20 copies/反应的靶基因,与WOAH推荐的实时荧光PCR方法(5 copies/反应)相近;特异性良好,与山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、赤羽病病毒(AKV)、蓝舌病病毒(BTV)及口蹄疫病毒(FMDV)均无交叉反应。其中,实时浊度法操作程序简单,实时荧光法反应快速(25 min内完成检测),荧光可视化法不依赖专用仪器及中心实验室。将所建方法应用于临床样本的检测,显示这3种方法均可特异性检测到LSDV,与实时荧光PCR方法检测结果一致性为100%,优于WOAH推荐的普通PCR方法。所建方法具有快速、特异、灵敏、操作简便且不依赖专用仪器等优点,可为LSDV的临床快速筛查提供技术支持。

猫传染性腹膜炎诊断方法研究进展

猫传染性腹膜炎(feline infectious peritonitis,FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的全身性、致死性疾病。近年来,FIP在世界各地广泛流行,感染率呈上升趋势。文章对FIP的诊断方法进行了全面总结,以期为FIP的临床和实验室诊断提供参考和指导。

牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的保守基因序列设计了特异性的引物和探针,建立了荧光定量PCR检测方法。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了试验,并用田间临床样品对该方法和OIE推荐的普通PCR进行了验证。结果显示,本研究建立的荧光定量PCR与绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;重组质粒标准品的检测限为1.16×100copies/μL;组间和组内的变异系数均≤2.00%。25份田间临床样品检测结果显示,本研究建立的荧光定量PCR阳性检出率为100%,而OIE推荐的普通PCR方法的阳性检出率为55.6%。上述结果表明,本研究建立的LSDV荧光PCR特异性强、敏感性高、重复性好,为牛结节性皮肤病的监测和防控提供了有效的技术手段。

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1:64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。