DENV-2诱导HUVECs自噬和影响细胞活力的研究

目的:通过利用登革Ⅱ型病毒(DENV-2)感染原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,研究病毒诱导HUVECs产生自噬和对细胞活力的影响。方法:利用DENV-2 NGC株感染HUVECs,Real-time PCR检测HUVECs中DENV-2 NS1基因部分系列的表达,给予自噬诱导剂雷帕霉素(RAPA)和自噬抑制剂氯喹(CQ)预处理观察细胞自噬通量变化,激光共聚焦显微镜观察自噬体形成;CCK-8检测细胞活力;Western blot检测自噬通量标志性蛋白LC3、P62的蛋白表达量。结果:DENV-2感染HUVECs组病毒NS1基因在各时间点均有表达;被感染的HUVECs在24 h时细胞活力下降不明显,36、48 h细胞活力分别下降至未处理组82.46%和78.47%,差异具有显著统计学意义(P<0.05);HUVECs被DENV-2感染后,LC3-Ⅱ蛋白量表达明显增高,自噬底物P62表达明显降低,36、48 h时间点相较未处理组具有统计学意义(P<0.05),与RAPA处理组结果相似(P>0.05)。CQ处理组LC3-Ⅱ及P62蛋白量表达均明显升高,36、48 h时间点相较未处理组具有显著性差异(P<0.05)。HUVECs被DENV-2感染36 h,激光共聚焦显微镜观察到LC3-Ⅱ表达明显高于未处理组,自噬诱导剂RAPA处理HUVECs后,LC3-Ⅱ表达明显增加,自噬强度更加明显。DENV-2与CQ联合处理组相较DENV单独处理组,36 h细胞活力下降了13.61%,差异具有显著统计学意义(P<0.05)。结论:DENV-2感染可抑制HUVECs的生长;而DENV-2诱导HUVECs产生的自噬却有利于HUVECs的存活。

登革病毒Ⅱ型引起原代HDMECs通透性变化机制的初步研究

目的:了解登革病毒Ⅱ型(Dengue virus Type 2,DENV-2)感染原代人真皮微血管内皮细胞(Primary Human dermal micro-vascular endothelial cells,p HDMECs)引起细胞通透性改变的机制。方法:用103TCID50的DENV-2感染p HDMECs;于4、8、12、24、48 h Real time-PCR、免疫荧光法及流式细胞术检测DENV-2 NS1部分序列及蛋白;Transwell法检测细胞通透性;Real time-PCR和双抗体夹心ELISA法检测IL-6和IL-8的变化;流式细胞术检测24、48、72 h细胞凋亡。结果:DENV-2感染的p HDMECs病毒NS1基因相对表达上调,但未检测到病毒NS1蛋白;DENV-2感染的p HDMECs通透性在24、48 h显著升高;p HDMECs被感染72 h后凋亡也无明显变化;IL-6和IL-8 mRNA分别在8、24 h相对表达上调[IL-6:(2.49±0.5)倍,P<0.05;IL-8:(6.82±1.69)倍,P<0.05];对照组和感染组分泌的IL-6于8 h分别为(869.6±50.7)、(1 248.8±86.9)pg/ml,P<0.05;IL-8于48 h分别为(967.6±156.6)、(1 331.0±86.3)pg/ml,P<0.05。结论:DENV-2能感染p HDMECs;p HDMECs被DENV-2感染后,细胞的通透性增加与凋亡无关,与促炎性细胞因子IL-6和IL-8明显上调关系密切。

桃汁酶解加工关键技术

本文以桃为原料,采用果胶酶酶解加工桃汁,研究了不同果胶酶酶解桃浆对桃出汁率和可溶性固形物含量的影响,并优化了果胶酶酶解桃浆的工艺条件。实验结果表明:选择C酶作为试验用酶;当加酶量为0.09‰,酶解时间30.0 min,酶解温度47.0℃,出汁率提高了14.79%。

慢病毒载体介导的RNA干扰对HDAC2基因表达的影响

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因的慢病毒表达载体,研究HDAC2基因在肝癌Hep G2细胞中的表达。方法:将前期构建并鉴定正确的3条重组表达质粒p LKO.1-HDAC2-shRNA 1组、2组、3组及1条阴性对照p LKO.1-HDAC2-shRNAneg和空载体对照p LKO.1,运用脂质体法分别与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染人胚肾细胞293T,制备具有感染能力慢病毒颗粒;收集、纯化含病毒颗粒的上清液并感染人肝癌Hep G2细胞,设未处理Hep G2细胞为空白对照,采用Real time PCR和Western blotting检测感染48 h和72 h后Hep G2细胞中HDAC2基因mRNA和蛋白表达水平,鉴定、分析重组质粒的干扰效果。结果:与空白对照组相比,3条干扰序列转染肝癌Hep G2细胞后均能明显抑制HDAC2 mRNA的表达(P<0.05),其中以p LKO.1-HDAC2-shRNA 1组的抑制率更明显,达到82.09%;3条干扰序列均能明显抑制HDAC2蛋白的表达(P<0.05),以p LKO.1-HDAC2-shRNA 1组和3组的干扰效果最明显,但两者相比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:构建的重组质粒p LKO.1-HDAC2-shRNA能从转录水平和蛋白水平有效抑制HDAC2基因在Hep G2细胞中表达。

HDAC2基因RNA干扰载体的构建

目的:构建组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因RNA慢病毒干扰质粒载体。方法:对比HDAC2基因序列,设计并合成短发夹RNA(shRNA)干扰靶点序列,克隆入经Age I与EcoRI双酶切后的RNA干扰载体p LKO.1-puro,构建p LKO.1-HDAC2-shRNA重组质粒,采用酶切法和测序法验证重组质粒。结果:成功退火合成3对短发夹RNA序列并将其克隆入p LKO.1-puro载体中,构建重组质粒p LKO.1-HDAC2-shRNA1、p LKO.1-HDAC2-shRNA2及p LKO.1-HDAC2-shRNA3,经酶切鉴定和测序验证重组质粒载体与预期靶序列相同。结论:成功构建HDAC2-shRNA慢病毒干扰载体,为进一步研究HDAC2的功能及应用提供有效工具。

Ⅱb型高脂血症中胱抑素C、同型半胱氨酸、超敏C蛋白的水平分析

目的通过对Ⅱb型高脂血症中胱抑素C(CysC)、同型半胱氨酸(Hcy)和超敏C反应蛋白(hs-CRP)的水平分析,评价CysC、HCY和hs-CRP三者在心血管疾病发生发展过程中有无早期临床预警作用。方法收集贵州医科大学附属医院体检标本,年龄在30~60岁之间。其中血脂正常者49例标本作为对照组,血脂异常者(诊断Ⅱb型高脂血症)107例作为实验组,实验组根据LDL值分为三组(0.68~3.00为低值组;>3.00~4.00为中值组;>4.00~5.55为高值组)。结果CysC、Hcy和hs-CRP的表达水平依据低值组、中值组、高值组和对照组顺序呈逐渐降低趋势,两两比较,差异均有统计学意义(P<0.01);实验组(低值组、中值组、高值组)组间比较发现,当Hcy>16.22±2.76(P<0.01)和CysC>1.38±0.19时,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在Ⅱb型高脂血症患者中CysC、Hcy和hs-CRP的血清的表达水平明显升高,CysC、Hcy和hs-CRP与Ⅱb型高脂血症患者疾病严重程度密切相关,通过健康查体检查CysC、HCY、hs-CRP水平分析,对心血管疾病的发生发展过程起到一定的预防作用。

DENV-2感染的HUVECs与调节性T细胞相互作用对主要炎性细胞因子产生的影响

目的研究人原代脐静脉内皮细胞（primary human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）被登革病毒2型（DENV-2）感染后，与调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）共培养，HUVEC与Treg细胞相互作用对各自主要炎性细胞因子的影响。方法用密度梯度离心法从人浓缩白细胞分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），磁珠阴性分选Treg细胞，流式细胞术检测CD4＋CD25＋CD127＋细胞纯度。HUVECs经DENV-2感染后，用Transwell与Treg细胞共培养，对照组用鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate, S1P）1型特异性受体激动剂CYM-5442预处理24 h去除药物后感染病毒，并与Treg细胞共培养，real-time RT-PCR分别检测HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α和Treg细胞的IL-10、TGF-β的mRNA转录水平；双抗体夹心ELISA法检测培养上清中上述细胞因子表达。结果感染后HUVECs中DENV-2 NS1基因转录水平逐渐上升，在24 h达到峰值（3.03±0.26，P〈0.01）后下降。流式细胞术检测经免疫磁珠阴性分选的Treg细胞纯度为（84.3±0.5）%。DENV-2感染后HUVECs的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA转录均有上调，感染后24 h IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录量分别为16.64±2.64、26.80±5.81和5.25±0.42，而未感染组的转录水平分别为1.70±0.68、1.68±0.74、1.45±0.15，与Treg共培养后上述细胞因子在各时间点的转录有所降低，但仍高于未感染DENV-2的对照组。CYM-5442预处理后被感染的HUVECs IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA转录水平显著下降；共培养的Treg细胞所产生的IL-10、TGF-β也下调。结论被DENV-2感染的原代HUVECs能增强Treg细胞IL-10与TGF-β的分泌，同时Treg细胞产生的抑制性细胞因子能降低被感染的HUVECs炎性细胞因子的产生。

登革病毒感染的人脐静脉内皮细胞与人CD4＋ T细胞相互作用对黏附分子和抑炎细胞因子表达的影响

目的 探讨Ⅱ型登革病毒（DENV-2）感染的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）与CD4＋T细胞的共培养对HUVECs表达细胞间黏附分子（ICAM-1）、血管细胞黏附分子（VCAM-1） mRNA和 CD4＋T细胞表达IL-10、TGF-β1 mRNA产生的影响,以进一步了解DENV感染的免疫学机制.方法 S1P1选择性激动剂CYM-5442处理HUVECs 24 h,用103半数组织培养感染剂量（TCID50）的DENV-2感染HUVECs后与人CD4＋T细胞共培养.于4、8、12、24、48及72 h,分别收集细胞样本,用real-time PCR检测DENV-2非结构蛋白1（NS1）、鞘氨醇激酶1（SPHK1）、ICAM-1、VCAM-1、IL-10、TGF-β1 mRNA表达变化.结果 HUVECs被DENV-2感染后,病毒NS1 mRNA的表达呈一定时效性,在24 h达到高峰.在DENV-2感染的不同实验组中,CYM-5442处理和未处理组,DENV-2 NS1 mRNA的表达均无明显差异.HUVECs被CYM-5442处理和DENV-2感染后,SPHK1 mRNA表达明显上升,差异有统计学意义（P〈0.05）;在DENV-2感染的HUVECs与CD4＋T细胞共培养的情况下,HUVECs ICAM-1和VCAM-1 mRNA高表达,相对HUVECs仅被DENV-2感染组和未处理组差异有统计学意义（P〈0.01）,CD4＋T细胞TGF-β1 mRNA表达无明显差异,IL-10 mRNA表达上调,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 实验证明DENV-2能在HUVECs内复制增殖,CD4＋T细胞可抑制DENV-2增殖;CD4＋T细胞对DENV-2感染的HUVECs产生黏附分子VCAM-1和ICAM-1有明显的促进作用,CD4＋T细胞可促使HUVECs活化,增强炎症反应,这可能与DENV-2感染诱发血管通透性升高有关.DENV-2感染的HUVECs对CD4＋T细胞IL-10 mRNA表达有一定上调作用,对TGF-β1的表达没有明显的影响.

2型登革病毒对原代人肝窦内皮细胞凋亡、自噬以及相关基因表达的影响

目的研究2型登革病毒（DENV-2）感染原代人肝窦内皮细胞（HHSECs）后，HHSECs的凋亡、自噬，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）及Beclin-1 mRNA水平的表达，分析DENV-2致病过程中可能的作用机制。方法用DENV-2（MOI＝1）作用于HHSECs，Real-time PCR动态检测DENV-2 NS1部分序列；CCK-8法动态检测DENV-2对HHSECs的毒性作用。real-time PCR动态检测被感染HHSECs的ICAM-1、Beclin-1 mRNA的表达水平。流式细胞术检测被感染HHSECs的细胞凋亡率，以及LC3B和ICAM-1的表达。结果被DENV-2作用后的HHSECs有NS1部分基因序列的表达。DENV-2感染细胞后，CCK-8法检测细胞的抑制率分别为（10.90±1.24）%（12 h）、（16.40±0.42）%（24 h）、（17.00±0.46）%（36 h）、（29.60±0.26）%（48 h）。Real-time PCR检测HHSECs中Beclin-1及ICAM-1 mRNA的表达，以未感染组为对照，2^－△△Ct值于24 h达峰值，分别为46.77±2.55和40.97±4.91。流式细胞术动态观察被DENV-2感染的HHSECs的凋亡，于12 h较明显，凋亡率为13.17%；36 h时LC3B的表达率（35.50%）达到峰值；ICAM-1的表达率分别为9.17%（12 h）、14.7%（24 h）、12.7%（36 h）、11.6%（48 h）。结论HHSECs对DENV-2易感。DENV-2可激活HHSECs，诱导ICAM-1上调；可促进自噬的发生，于早期诱导HHSECs细胞凋亡。

1，25二羟维生素D3对肝癌HepG2细胞增殖侵袭影响

目的探讨1,25二羟维生素D3[1,25(OH)_2D_3]及PI3K/AKT信号通路抑制剂(LY294002)对人肝癌Hep G2细胞的增殖、侵袭影响及作用机制。方法实验设10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)mol/L 1,25(OH)_2D_3组及2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μmol/L LY294002组,10^(-7)mol/L 1,25(OH)_2D_3+5μmol/L LY294002联合组,噻唑蓝法检测人肝癌Hep G2细胞增殖抑制率;Compu Syn软件计算联合指数;Tanswell小室检测HepG2细胞侵袭数;Western blot检测Hep G2细胞增殖细胞核抗原(PCNA),细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)、磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、10号染色体缺失且与张力蛋白同源物磷酸脂酶基因(PTEN)蛋白。结果 1,25(OH)_2D_3及LY294002对人肝癌HepG2细胞增殖抑制率呈时间-剂量依赖效应(P<0.05);1,25(OH)2D3联合LY294002组细胞增殖抑制率明显高于二者单独处理组(P<0.05),联合指数=0.728,2者具有协同效应;10-7mol/L 1,25(OH)2D3组、5μmol/L LY294002组以及联合组Hep G2细胞侵袭数[分别为(45.9±6.4)、(49.9±6.0)、(27.8±4.0)个]明显低于对照组[(64.6±8.0)个](P<0.05)。与对照组比较,10-7mol/L 1,25(OH)2D3组及联合组HepG2细胞PTEN蛋白表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05),10-7mol/L 1,25(OH)_2D_3组、5μmol/L LY294002组及联合组HepG2细胞PCNA、MMP-9、p-AKT蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05),且联合组蛋白表达量低于二者单独处理组(P<0.05)。结论 1,25(OH)_2D_3可抑制人肝癌HepG2细胞增殖、侵袭,其机制可能与上调PTEN表达,抑制PI3K/AKT信号通路活性,下调PCNA、M M P-9蛋白有关;与LY294002合用具有协同效应。