单核细胞增生李斯特菌LIPI-4对脑及脑微血管内皮细胞炎症小体表达的影响

目的 探究单核细胞增生李斯特菌毒力岛4(LIPI-4)对小鼠脑及脑微血管内皮细胞炎症小体产生的影响。方法 小鼠腹腔注射细菌Lm928和Lm928ΔLIPI-4,采用甲酞胺一紫外分光光度法检测脑组织中伊文思蓝(EB)的含量,ELISA方法检测小鼠血清中髓鞘碱性蛋白(MBP)的水平,qRT-PCR法检测脑组织中炎症小体AIM2、NLRP3、NLRC4,炎症因子IL-1β、IL-18等的表达。qRT-PCR、Western Blot和ELISA检测Lm928、Lm928ΔLIPI-4和CLm928ΔLIPI-4侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)过程中炎症小体相关分子及炎症因子表达的水平。结果 小鼠感染Lm928 36 h后脑内EB显著升高,72 h后,血清中MBP含量极显著高于Lm928ΔLIPI-4组(P<0.01),qRT-PCR结果显示Lm928组小鼠脑组织NLRC4和IL-1β的mRNA表达量显著高于Lm928ΔLIPI-4组(P<0.05)。在侵染HCMEC/D3细胞中,NLRP3和IL-1β的mRNA表达量,Lm928组极显著高于Lm928ΔLIPI-4组(P<0.01);NLRP3的蛋白表达量,Lm928组极显著高于Lm928ΔLIPI-4组(P<0.01);上清液中IL-1β的分泌量,Lm928组极显著高于Lm928ΔLIPI-4组(P<0.01)。结论 单核细胞增生李斯特菌LIPI-4通过参与NLRP3/NLRC4/IL-1β通路,激活炎症小体参与炎症反应,损伤脑组织与脑微血管内皮细胞,破坏血脑屏障。

单核细胞增生李斯特菌LIPI-4 Lm4b_02327的基因克隆、生物信息学分析及原核表达

目的 试验旨在获得单核细胞增生李斯特菌新疆冷冻鸡肉分离株LM928中LIPI-4 Lm4b_02327基因的重组蛋白。方法 根据Gen Bank中LM Clip80459菌株(登录号CAS06084.1)Lm4b_02327序列设计特异性引物,利用PCR对Lm4b_02327基因进行扩增,纯化目的片段后克隆至pMD19-T载体,双酶切筛选阳性克隆进行测序。测序后利用软件预测Lm4b_02327序列编码蛋白质的理化性质、二级结构和三级结构,对该基因片段的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行同源性对比。同时构建pET32a-Lm4b_02327重组质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达,经SDS-PAGE检测、纯化蛋白后用Western Blot鉴定。结果 LM928菌株的Lm4b_02327基因全长为315 bp,共编码105个氨基酸,该蛋白为偏酸性、无信号肽、亲水性、无跨膜结构、定位于细胞质的不稳定蛋白,该蛋白质预测为PTSLacEⅡA组分。LM928菌株Lm4b_02327基因的核苷酸和氨基酸序列与CFSAN023463、52854、02-6680、02-6679、ICDC-LM188、LM3、N2306、GTA-L356和Clip80459菌株的同源性均为100.0%,与52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的核苷酸同源性分别为99.7%、97.8%和97.8%,与52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的氨基酸同源性分别为99.0%、94.3%和94.3%。系统进化树显示,LM928菌株的Lm4b_02327基因与4b血清型菌株聚为同一分支。经诱导后,pET32a-Lm4b_02327重组质粒在大肠杆菌BL21中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明该重组蛋白大小约为30 kDa,与预期大小一致。结论 本研究成功克隆Lm4b_02327基因,并获得该蛋白的大量表达,为深入研究蛋白功能奠定基础。

散养生猪疫病防控中存在的问题及对策

在散养养殖模式下,由于众多养殖户忽视环境调控、养殖地点分散、圈舍建设不完善,导致各类传染性疾病的传播风险显著增加。加之大部分养殖户对疫病防控的认知不足、防控水平低下以及资金投入有限,为传染性疾病的大范围传播提供了条件。本文结合实际工作经验,探讨了散养生猪疫病防控存在的问题,并提出了相应的防控对策,旨在为推动生猪养殖业的高质量发展提供助力。

下一代网络背景下的数字内容产业发展分析

本文分析了下一代网络对数字内容产业发展的影响,并对下一代网络背景下数字内容产业的发展提出了建议。

LIPI-4 EⅡC调控单增李斯特菌关键毒力因子转录的研究

【目的】探究单增李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶ⅡC(EⅡC)对LM关键毒力基因表达的影响。【方法】构建分离株LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC,测定各菌株的生长曲线和对不同糖的发酵情况,测定侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后的黏附、侵袭和胞内增殖能力,利用实时荧光定量PCR方法检测在脑心浸液(BHI)培养条件下和侵染HCMEC/D3后各菌株毒力基因的转录水平。【结果】成功构建LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC。EⅡC基因的缺失不影响LM928的生长和对葡萄糖、纤维二糖、果糖、鼠李糖、七叶苷和水杨苷的发酵。EⅡC基因缺失后,LM928对HCMEC/D3的侵袭率极显著下降(P<0.01),黏附能力无显著变化(P>0.05)。LM928ΔEⅡC胞内增殖菌量在2~4 h时显著低于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05),但在8~12 h时均显著高于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05)。在BHI培养条件下,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、prfA、actA、plcB、inlA、inlB、inlC和mpl转录水平极显著下调(P<0.01),毒力基因plcA转录水平极显著上调(P<0.01);在侵染HCMEC/D3后,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、prfA、inlB、inlC和mpl转录水平相对于LM928和CLM928ΔEⅡC显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),毒力基因plcA和inlA相比于CLM928ΔEⅡC极显著下调(P<0.01),毒力基因actA和plcB转录水平无显著差异(P>0.05)。【结论】LIPI-4中EⅡC不参与LM928的生长及其对部分糖的发酵,能调控LM中重要的侵袭相关基因和毒力相关基因。本试验结果为进一步探究EⅡC在LM和LIPI-4中的作用奠定基础。

炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202 PA-LF 1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF 1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF 1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(+)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF 1和PA-LF 1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF 1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。

LIPI-4 EⅡA基因对单核细胞增生性李斯特菌重要毒力基因转录调控作用的研究

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)的膜透性酶ⅡA(EⅡA)基因在LM中的毒力作用,本研究利用同源重组技术构建了具有遗传稳定性的LM928菌株EⅡA基因缺失株(LM928ΔEⅡA)和回补株(CLM928ΔEⅡA),通过对缺失株、回补株和亲本株生长特性测定分析EⅡA基因对LM体外生长能力的影响。提取各菌株RNA,反转录为c DNA后通过real-time PCR检测各菌株在体外培养条件下LM重要毒力基因的转录水平,分析EⅡA基因缺失对LM毒力基因转录水平的影响。结果显示,缺失EⅡA基因后不影响细菌在体外的生长能力,但细菌plcB和inlA基因的转录水平显著下调(P<0.05),hly、prfA、plcB、inlA、inlB、inlC和mpl基因的转录水平极显著下调(P<0.01),plcA基因的转录水平极显著上调(P<0.01),而actA基因的转录水平无明显变化(P>0.05)。将LM928、LM928ΔEⅡA和CLM928ΔEⅡA菌株分别感染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后,采用CCK8法检测EⅡA基因对HCMEC/D3活性的影响,同时通过胞内增殖试验检测EⅡA基因对LM胞内增殖的影响,进一步采用real-time PCR方法检测EⅡA对细胞毒力基因转录水平的影响,结果显示,与LM928组相比,LM928ΔEⅡA组HCMEC/D3细胞活性无明显改变;LM928ΔEⅡA感染HCMEC/D3后6 h~12 h,胞内LM928ΔEⅡA载菌量极显著高于胞内LM928载菌量(P<0.01),在感染HCMEC/D3后2 h~12 h,胞内LM928ΔEⅡA载菌量也极显著高于胞内CLM928ΔEⅡA的载菌量(P<0.01)。相对于亲本株,LM928ΔEⅡA感染的细胞中毒力基因prf A、plc A、plc B、inl A、inl B、inl C和mpl转录水平均极显著上调(P<0.01),actA基因的转录水平显著上调(P<0.05),hly基因的转录水平极显著下调(P<0.01)。本研究结果首次证实LIPI-4中EⅡA基因对LM体外生长无影响,但其对体内、外LM毒力因子的转录均具有显著的调控作用,提示LM LIPI-4可能通过EⅡA参与调控细菌毒力,该结果为进一步研究LIPI-4在LM致病中的作用奠定了基础。

绿茶渣对赤水乌骨鸡蛋壳厚度及SLC26A9基因表达的影响

为了探究绿茶渣对蛋壳厚度相关基因的影响,笔者选取300日龄的赤水乌骨鸡母鸡360只,随机分成4个组,即对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组,每组90只,分别饲喂添加0.00%、0.80%、1.60%和2.40%绿茶渣的饲粮。饲养试验结束后,利用实时荧光定量PCR技术检测赤水乌骨鸡卵壳腺和肝脏中溶质载体26A家族成员9(Solute carrier family 26 member9,SLC26A9)基因的表达量。结果显示,添加1.60%绿茶渣时卵壳腺中SLC26A9基因的表达量显著降低(P<0.05);添加0.80%和2.40%绿茶渣时SLC26A9基因在肝脏中的表达量显著升高(P<0.05);添加不同比例的绿茶渣均使得蛋壳厚度显著降低(P<0.05)。推测绿茶渣可能是通过影响SLC26A9基因的表达,从而导致蛋壳厚度变薄。该结果可为赤水乌骨鸡蛋壳品质的研究提供理论参考。

基于伸缩窗口STFT的信号调制的识别研究

伸缩窗口短时Fourier变换(STFT)通过对窗函数引入伸缩变换对短时Fourier变换进行改进,实现时频分辨率随信号频率变化自动可调,能较好地刻画信号中的瞬态结构.本文把伸缩窗口短时Fourier变换这种时间-频率-尺度三维信号处理方法引入到了数字通信信号调制盲识别领域,对ASK、FSK和PSK信号的伸缩窗口STFT——域特征进行了理论分析和软件仿真,最后给出了识别算法和仿真结果.仿真实验结果及性能分析表明,该算法是可行的,具有较好的抗噪声性能.

LIPI-4EII对单核细胞增生性李斯特菌关键毒力因子转录调控的影响

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶(EII)对LM毒力基因表达的调控作用,本研究分别构建EII缺失株(LM928ΔEII)、强启动子回补株(CLM928ΔEII-P_(help))和天然启动子回补株(CLM928ΔEII-P_(native)),测定各菌株在体外培养中的生长曲线和在永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)内的增殖情况;RT-qPCR检测体外培养和HCMEC/D3细胞内各菌株9个关键毒力基因的转录水平。结果显示:(1)EII基因缺失株LM928ΔEII构建成功,重组回补质粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-P_(native)及回补株CLM928ΔEII-P_(help)和CLM928ΔEII-P_(native)构建成功。(2)在体外培养下,EII对LM的生长曲线没有影响。但在侵染HCMEC/D3后,LM928ΔEII在8和12 h的胞内细菌量显著高于LM928(P<0.05),2和4 h的胞内细菌量极显著高于LM928(P<0.01),CLM928ΔEII-P_(native)在2、4和6 h恢复至野生株水平(P>0.05),而CLM928ΔEII-P_(help)在2、4、6、8、10和12 h均极显著低于野生株(P<0.01)。(3)体外培养条件下,相比于野生株,LM928ΔEII中66.7%(6/9)的毒力基因转录水平极显著上调(P<0.01);CLM928ΔEII-P_(help)中66.7%(6/9)的基因转录水平上升1~4倍,CLM928ΔEII-P_(native)中88.9%(8/9)的基因转录水平倍数变化在1倍以内。在HCMEC/D3细胞内,相比于野生株,LM928ΔEII中66.7%(6/9)的毒力基因转录水平极显著上调(P<0.01);CLM928ΔEII-P_(help)中33.3%(3/9)的基因转录水平上调1~3倍,CLM928ΔEII-P_(native)中基因转录水平倍数变化在1倍以内。综上,LIPI-4 EII对LM关键毒力因子的转录具有负调控作用。本研究为系统探究LIPI-4参与LM致病性机制奠定基础。