基于超高压技术的牛骨蛋白绿色提取工艺初探

为研究绿色牛骨蛋白提取工艺,利用超高压技术在温和环境中破坏骨结构,加速牛骨蛋白释放。以脱钙牛骨粉为实验对象,通过单因素和响应面优化实验,研究保压时间、作用压力和环境pH在牛骨蛋白超高压提取工艺中对蛋白提取率的影响,得出超高压提取牛骨蛋白的最佳条件。响应面实验回归模型显著,误差较小,模型适用于本实验理论解释。结果表明,在保压时间54 min、作用压力189 MPa和环境pH 6.7时蛋白提取率最高,可达35.62%,与理论模型预测值吻合度达98.8%。将提取次数增加到3次,提取率可达54.2%,结合酶提取率可达59.3%。建立超高压提取牛骨蛋白工艺,实现牛骨蛋白的绿色提取。

高产谷胱甘肽的酵母融合菌株的选育及其培养条件的研究

通过初筛、单倍体分离、诱变及原生质体融合技术选育到一株谷胱甘肽产量明显提高的融合菌株ZJF 71 ,其谷胱甘肽产量分别为亲株的 1 .5 9和 1 .42倍。并对其培养条件进行了研究 ,结果表明碳源、装液量和培养时间对融合菌株ZJF 71生产谷胱甘肽的影响较为显著。在优化的培养条件下 ,发酵液中谷胱甘肽总量达到 1 85 .3mg L ,为初始培养条件下的 2 .8倍。经遗传稳定性分析 ,证明融合菌株ZJF - 71是遗传稳定的。

胶原蛋白肽分子量对吸收过程的影响研究

利用大鼠研究脯氨酸被吸收后羟基化修饰对血液和尿液中羟脯氨酸含量的影响,在此基础上利用平均分子量分别为1 kDa、3 kDa和大于20 kDa的胶原蛋白肽考察了分子量范围对多肽吸收速率的影响。结果表明平均分子量为1 kDa和3 kDa的吸收速率高于平均分子量20 kDa的胶原蛋白肽,平均分子量1 kDa的多肽吸收速率高于平均分子量3kDa的多肽。实验借助胃炎大鼠模型考察了胃功能缺陷对不同分子量的多肽吸收速率的影响,证明了高分子量多肽由于吸收速率较低导致在血浆中Hyp浓度衰减速率较低,而低分子量多肽受胃消化过程影响较小。

高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠肝、肺、肾中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量

建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定小鼠肝、肺、肾中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量。首先识别小鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白特征多肽,分别为GSEGPQGVR、GPSGFR。采用子离子及保留时间定性,以GLAGMK为内标对小鼠肝、肺、肾中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量进行分析。结果表明,2个特征多肽在1~500 mg/L浓度范围内的线性关系良好,相关系数均大于0.99,精密度相对标准偏差小于3.7%,加标回收率在86%~118%之间。小鼠生长过程中,肝、肺、肾中Ⅰ型胶原蛋白的比例呈增加趋势,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白总量呈先增加后降低的趋势。该方法前处理简便高效、精密度高、重现性好,可用于小鼠肝、肺、肾中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的精确定量。

离子交换配基密度对蛋白质吸附行为的影响

利用双偏振极化干涉测量仪(DPI)研究了离子交换配基密度对蛋白质吸附行为的影响。用N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(DAPTMS)对DPI芯片进行修饰,利用X射线光电子能谱表征了芯片上配基密度的差异。以溶菌酶、细胞色素C、糜蛋白酶、牛血清白蛋白和免疫球蛋白为模型蛋白,利用DPI研究了5种蛋白质在不同配基密度界面上吸附量、吸附密度和空间形态。结果表明,随着配基密度的增加,蛋白在界面上的吸附量、吸附密度随之增加,起始吸附速率随之增大;蛋白的空间形态与配基密度密切相关,特别是免疫球蛋白,蛋白层厚度远小于其分子直径,空间形态发生变化。证明配基密度是影响界面上蛋白质吸附量、吸附密度和空间形态等吸附行为的关键因素。

山茱萸环烯醚萜苷对小鼠血管内皮细胞的作用

对山茱萸环烯醚萜苷类(Cornus iridoid glycosides,CIG)成分进行提取、富集和鉴定,并探究其对血管内皮细胞增殖、形态和凋亡的影响。通过超声提取CIG并经D101大孔树脂去除色素和糖等影响检测的成分,CIG提取物经HPLC-MS检测并与标准品比对和鉴定。通过细胞增殖实验、激光共聚焦显微镜观察和细胞凋亡实验探究CIG对小鼠血管内皮细胞(b.end.3)的影响。结果表明,0.5~50μg/mL CIG可不同程度地促进血管内皮细胞增殖活性,抑制因高糖引起的细胞萎缩和凋亡。山茱萸作为药食同源的中药材可在一定程度上降低血栓形成的风险。

分子量均一范围可控的胶原蛋白多肽制备技术

以胶原蛋白的热稳定性为基础,考察了基于多级逆流固液萃取技术的鱼鳞胶原蛋白提取工艺,探讨了酶促反应和膜分离耦合技术用于制备胶原蛋白多肽的可行性。鱼鳞经预处理后置于多级逆流固液萃取连续反应釜,在温度为80℃条件下可连续提取胶原蛋白,该制备工艺具有胶原蛋白随机降解率低、分子量高和节水等优点。在此基础上研究了酶促反应和膜分离耦合技术制备胶原蛋白多肽的工艺,考察了蛋白与酶的比例,切向流速率、温度等操作参数,该制备工艺具有分子量均一和范围可控的优点。将多级逆流固液萃取技术和酶促反应-膜分离耦合工艺集成制备了不同分子量范围的胶原蛋白多肽。

胶原蛋白肽氨基酸组成对小鼠肠道吸收的影响研究

研究了胶原蛋白肽氨基酸组成对其在小鼠体内吸收程度的影响。利用离子交换层析分别制备出富含碱性和酸性氨基酸的胶原蛋白肽,小鼠灌胃后检测了血清中羟脯氨酸和胶原蛋白降解后的多肽相对丰度的差异。氨基酸组成分析结果表明阳离子交换层析制备的胶原蛋白肽(CPC)富含精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys),含量比未经过层析分离的多肽(CPo)分别高12.2%和7.4%。阴离子交换制备的多肽(CPA)中Arg和Lys含量比CPo低18.3%和26.5%。通过离子阱质谱技术从CPC中检测到9种含Arg或Lys的多肽,其含量远大于CPA中的含量。动物实验结果表明CPC在小鼠体内吸收高于CPA,小鼠血清中CPC在吸收峰值时Hyp的浓度是CPA的1.39倍,采用三重四级杆质谱(TSQ)从CPC灌胃后小鼠血清中检测出含Hyp的寡肽(Ser-Hyp-Gly、Pro-Hyp-Gly、Leu-Hyp),3种寡肽分别是CPA灌胃后小鼠血清中浓度的2.1、1.48和1.51倍,初步证明了氨基酸组成是影响胶原蛋白肽在小鼠体内吸收的重要因素。

超大孔聚苯乙烯微球固定蛋白质

采用琼脂糖对孔径为300～500nm的超大孔聚苯乙烯(MPS)微球进行亲水化修饰,并在修饰后的表面上偶联病毒蛋白颗粒(RV),用于蛋白质的分离纯化实验.结果表明,经过修饰的MPS层析介质具有优异的流体力学性能,层析过程的最高流速可达1120cm/h,对病毒蛋白颗粒的固定量为0.638mg/g,是商品化介质Sepharose 4FF的2倍.采用RV-MPS介质对病毒蛋白颗粒抗体进行了分离纯化,收率为29.22%,高于Sepharose 4FF的18.92%.

DEAE-琼脂糖LB膜的制备与表征

由于单分子膜性能独特,受到关注度越来越高,利用LB膜技术制备了二乙氨乙基(DEAE)-琼脂糖单分子层。分析其表面压(π)-面积(A)曲线,崩溃压较高,成膜过程明显。研究浓度对DEAE-琼脂糖成膜情况的影响,确定最佳成膜浓度为0.5 mg/m L。考察配基密度与表面电势的关系,其表面电势随着配基密度的增加而增大。采用原子力显微镜(AFM)和布鲁斯特角显微镜(BAM)对制备的LB膜进行了表征,得出表面膜的表面平整、紧密,厚度约为7.9 nm。DEAE-琼脂糖LB膜制备成功,为以后LB膜技术的广泛应用提供了一种新的材料。

基于点击化学的琼脂糖微球上溶菌酶定点偶联方法研究

以溶菌酶为模型,研究了一种基于点击化学的琼脂糖微球上蛋白质定点偶联方法。首先将琼脂糖微球使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚活化后与对氨基苯乙炔反应,将炔基引入琼脂糖微球。其次合成了叠氮基癸酸,通过EDC/NHS法将叠氮基癸酸偶联到溶菌酶表面,将不同修饰位点的溶菌酶进行色谱分离后,通过点击化学使溶菌酶分子上叠氮基与琼脂糖微球表面上的炔基进行反应。XPS分析结果表明偶联对氨基苯乙炔后的琼脂糖微球表面出现N元素,证明炔基成功偶联在微球表面。采用合成的叠氮基癸酸对溶菌酶进行修饰,质谱分析结果表明叠氮基主要出现3个位点,Lys^1、Lys^(33)和Lys^(96)。将偶联位点为Lys^(96)的溶菌酶进行了分离,通过点击化学反应将溶菌酶偶联在琼脂糖微球表面,质谱分析结果表明偶联的溶菌酶其酶解产物中未检测出多肽Gln^(74)-Lys^(96),证明溶菌酶通过Lys^(96)偶联在琼脂糖微球表面。该研究为偶联位点均一、可控的蛋白质偶联方法提供了参考。

胶原海绵与脱细胞基质在大鼠体内的降解过程

针对胶原基生物材料,通过不同方法研究了基于牛胶原的海绵和脱细胞基质材料的降解过程,比较两种材料的降解规律,定量考察了胶原基材料体内降解周期。通过在SD大鼠脊柱两侧皮下分别植入胶原海绵与脱细胞基质,在不同周数取样,分别观察两种材料降解程度并称重建立降解曲线,利用高效液相色谱质谱联用技术筛选出牛I型胶原的特征多肽GEGGPQGPRG,并进行定量分析。分批次将大鼠体内残留部分进行酶解,再利用三重四极杆质谱对特征肽进行定量,建立降解曲线。结果表明,脱细胞基质与胶原海绵体内降解趋势相似。胶原海绵降解8周特征肽浓度为(0.40±0.10)×10^-5 mg/mL,表明胶原海绵降解较为完全。脱细胞基质降解16周特征肽浓度为(1.30±0.11)×10^-5 mg/mL,表明脱细胞基质降解较为完全。

用于MALDI-TOF MS分析的毛细管层析柱制备方法研究

研究了一种用于MALDI-TOF MS分析中样品预处理毛细管亲和层析柱的制备方法。首先采用硫酸和双氧水氧化法将羟基引入到石英毛细管内表面,进一步使用氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)对毛细管进行修饰以将氨基偶联到毛细管内表面;采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)将魔芋葡甘聚糖(KGM)进行活化,将活化后的KGM与毛细管上的氨基进行了偶联,在此基础上将模型蛋白(胰蛋白酶)偶联到毛细管内KGM,成功制备出毛细管亲和层析柱,考察了KGM和环氧基含量对模型蛋白偶联量及其样品预处理效果的影响。结果表明,KGM分子量是影响毛细管层析柱上蛋白偶联量的关键因素,以胰蛋白酶抑制剂为目标物结合MALDI-TOF MS对亲和层析柱的分离效果进行了评价,证明了偶联胰蛋白酶的毛细管层析柱可有效实现胰蛋白酶抑制剂的分离和浓缩。基于表面处理和KGM衍生的毛细管亲和层析柱制备技术具有可行性,并可用于MALDI-TOF MS分析的样品预处理。

不同因素对酶联免疫法测定破伤风免疫球蛋白活性的影响

目的考察不同因素对酶联免疫法（ELISA）测定破伤风免疫球蛋白生物活性的影响。方法将破伤风免疫球蛋白加入不同pH的缓冲液、不同浓度的氯化钠、硫酸铵以及聚乙二醇（PEG，相对分子质量为1000，6000和10000）溶液，采用ELISA法测定其活性。结果pH5～9的缓冲溶液对活性测定的影响不大，而pH≤4和≥10的缓冲溶液都会使测定值显著降低，当pH〈2或pH〉12时，活性下降到正常值的10％以下。随氯化钠浓度的增加测定值先下降到正常值的37．3％，后回升到41．2％，再下降；随硫酸铵浓度的增加测定值先下降到正常值的67％，后回升到99．4％，再下降。PEG对活性测定有较大影响，随PEG浓度的增加活性测定值降低。结论缓冲液pH、盐以及PEG对破伤风免疫球蛋白活性测定有影响。

基于生物质谱的胶原蛋白定量检测方法

本研究旨在建立一种基于特征多肽的胶原定量检测方法,通过序列比对的方法筛选胶原蛋白特征多肽,利用胰蛋白酶将牛Ⅰ型胶原蛋白标准品进行酶解,采用液质联用技术(HPLC-MS)对特征多肽进行检测,建立特征多肽丰度与胶原蛋白浓度对应关系并用于实际样品分析。结果表明,牛Ⅰ型胶原蛋白中检测出6种特征多肽,其中多肽GEAGPSGPAGPTGAR由于其丰度高且二级质谱稳定适合作为定量检测的特征多肽,多肽信号强度与蛋白浓度(0.1-3.0 mg/m L)呈良好线性关系。将所建方法用于实际样品分析,牛跟腱胶原蛋白含量为90.2%,胶原海绵中胶原蛋白含量为93.4%,检测结果与基于氨基酸组成分析的结果一致。该研究表明基于HPLC-MS的特征多肽分析方法进行胶原蛋白定量检测具有可行性,该方法在含胶原蛋白医疗器械等生物制品质量控制方面具有应用前景。

PEG化rhG-CSF的修饰位点识别研究

研究聚乙二醇(PEG)修饰的重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)上PEG的偶联位点识别方法。采用聚乙二醇单甲醚琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC 5k)修饰rhG-CSF,利用凝胶过滤法对PEG-rhG-CSF进行分离;采用质谱分析结合胰蛋白酶和糜蛋白酶降解法以及氨基酸组成分析法等技术,研究PEG-rhG-CSF上PEG偶联位点识别方法。胰蛋白酶降解法结合质谱分析结果表明PEG-rhG-CSF酶解产物中N末端多肽T1PLGPASSLPQSFLLK16的残留量为4%,多肽C17LEQVR21的残留量为96%,表明96%的修饰位点发生在N末端的苏氨酸上,4%的修饰位点发生在16位的赖氨酸上,实验采用糜蛋白酶降解法和氨基酸组成分析法进一步测定了PEG修饰位点以及不同修饰位点的比例,与基于胰酶降解和质谱分析法获得的偶联位点结果一致。结论:采用多种方法对PEG-rhG-CSF上PEG偶联位点进行了识别。胰蛋白酶降解法无需对不同修饰位点的PEG-rhG-CSF进行分离,通过多肽含量变化可获得识别修饰位点及比例,HPLC分析过程中多肽分离度对定量结果有影响。胰蛋白酶降解法结合糜蛋白酶降解法直接获得PEG偶联位点信息,但糜蛋白酶降解位点较多,影响方法的通用性。反相色谱法或基于氨基酸组成分析的方法操作过程简单,但准确度较低。

燕窝酶解产物中多肽的液相色谱质谱分析

目的:针对燕窝中蛋白质糖基化程度不均一和相对分子质量范围不稳定,以及由此导致的蛋白质难以分离、分析和鉴别的问题,研究1种燕窝中蛋白质和多肽的分析方法。方法:利用分步法从燕窝中提取了蛋白质组分,采用糖苷酶和蛋白酶对蛋白质组分进行了处理,采用生物质谱技术对蛋白质降解物进行了分析,并对其中的多肽进行了序列分析。结果:燕窝中的蛋白提取率为79.7%,采用多级质谱技术从提取蛋白质的糖苷酶和胰蛋白酶处理后的混合物中检测出20种多肽。结论:这些多肽的序列与已有蛋白质数据库中不同种类蛋白的局部序列相似,为富含糖蛋白的动物药成分研究提供了技术参考。

小鼠生长过程中肝、肺、肾胶原蛋白与MMP-1含量变化

利用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunoassay,ELISA)对小鼠生长过程中肝、肺、肾胶原蛋白与基质金属蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1,MMP-1)含量变化规律进行研究。以0–18周的小鼠肝、肺、肾为研究对象,通过HPLC法对不同周龄小鼠肝、肺、肾中羟脯胺酸(Hydroxyproline,Hyp)含量及比例进行测定,并换算得到胶原蛋白的含量;利用ELISA检测不同周龄小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量和活性。结果表明,小鼠肝、肺、肾中胶原含量各不相同(肺(COL)>肾(COL)>肝(COL)),且随着周龄的增加胶原蛋白含量变化均呈先增加后降低的趋势。其中肝、肺、肾中胶原蛋白含量分别在第9、6、9周达到最高值,分别为5.52 ng/mg、54.10 ng/mg、19.20 ng/mg;9–18周呈缓慢降低趋势。ELISA检测结果表明,小鼠肝、肺、肾中MMP-1的含量随周龄增加呈先降低后增加的趋势,MMP-1活性的变化趋势与之相反。这表明组织内胶原蛋白含量的增加会抑制MMP-1的分泌。

亲和层析介质上蛋白质偶联位点的控制方法

以溶菌酶为模型蛋白,将其偶联在环氧活化的琼脂糖介质上,采用液质联用技术结合蛋白质酶切技术对琼脂糖介质表面配基蛋白的偶联位点进行了识别,考察了活化时间、偶联时间和溶液pH值对偶联位点的影响.结果表明,环氧基密度为11.34μmol/g、反应pH9.5条件下,溶菌酶偶联位点发生在K96,延长偶联反应时间蛋白配基偶联量增加,对偶联位点种类无显著影响;增加环氧基密度或提高偶联反应pH值使溶菌酶通过多种位点偶联,在pH≥10.5条件下偶联位点主要发生在K33,K96和K97.

界面上配基种类对BSA吸附行为的影响

利用双偏振极化干涉测量仪(DPI)研究了界面上配基种类对BSA吸附行为的影响。采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(甲氨基)丙基三甲氧基硅烷(MAPTMS)和N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷(DAPTMS)对DPI芯片进行了修饰,利用X射线光电子能谱比较了芯片上不同配基的密度,采用原子力显微镜(AFM)和DPI对界面上BSA吸附行为进行了研究。结果表明APTES修饰界面上BSA呈饼状,高配基密度易导致BSA多位点吸附。相同偶联密度条件下BSA在DAPTMS修饰芯片的吸附量高于MAPTMS修饰芯片,但吸附层厚度一致,表明DAPTMS表面上BSA存在聚集现象;AFM扫描结果与DPI分析结果一致,证明了配基密度和种类不仅影响界面上蛋白质吸附量,而且影响蛋白质吸附密度和表面聚集行为。