α-龙葵碱通过WNT信号通路抑制曲古抑菌素A-耐药人胰腺癌细胞的上皮-间质转化进程

目的探究α-龙葵碱对曲古抑菌素A-耐药胰腺癌细胞凋亡、侵袭和迁移能力的影响,探究α-龙葵碱对胰腺癌上皮-间质转化(EMT)的影响。方法采用不同浓度的α-龙葵碱(0 μg/mL,2 μg/mL,4 μg/mL和6 μg/mL)处理曲古抑菌素A-耐药胰腺癌细胞,使用Transwell和划痕试验来检测曲古抑菌素A-耐药胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力变化。然后,通过RT-PCR和Western blotting检测相关的EMT标记物波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、β-连环蛋白(β-catenin)、p-β-连环蛋白(p-β-catenin)、Frizzled家族蛋白7(Frizzled7)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)表达情况。结果与正常对照组(无α-龙葵碱处理)相比,实验组中无毒性剂量下的α-龙葵碱处理后,划痕试验中曲古抑菌素A-耐药胰腺癌细胞的侵袭迁移能力显著降低(P<0.05);EMT相关蛋白中,E-钙黏蛋白α表达水平增加(P<0.05),N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-2的表达水平下降(P<0.05)。此外,实验组中,经α-龙葵碱处理后,曲古抑菌素A-耐药胰腺癌细胞的β-连环蛋白上游基因Fizzled7和GSK3β的表达水平下降(P<0.05)。结论本研究结果表明,α-龙葵碱可能通过WNT/β-连环蛋白信号通路来调节曲古抑菌素A-耐药胰腺癌细胞的EMT进程,发挥其抗肿瘤作用。

胞外热休克蛋白70在急性胰腺炎肺损伤中的调节作用

目的:探讨胞外热休克蛋白70(HSP70)在急性胰腺炎(AP)并发急性肺损伤过程中的调节作用。方法:构建不同胞外HSP70表达量的相关AP小鼠模型,通过检测胰腺含水量、胰腺和肺脏组织HE染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)实验、肺脏组织转录组测序、RT-PCR等实验,观察不同胞外HSP70表达水平在AP急性肺损伤中所起的作用。结果:在胰腺含水量、胰腺和肺脏组织HE染色实验中,较高的胞外HSP70水平表现为更高的胰腺含水量,胰腺组织和肺脏组织水肿更明显(P<0.05);在ELISA实验中,较高的胞外HSP70水平亦伴随着较高的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平(P<0.05);在肺脏组织转录组测序实验中,AP组导致的基因表达量改变现象最显著,且其主要影响ECM-receptor interaction、Cytokinecytokine receptor interaction、Focal adhesion、PI3K/Akt等信号通路,改变细胞黏附功能。在RT-PCR实验中,改变最为显著的相关基因的表达量改变与转录组测序结果相一致。结论:胞外HSP70可加重AP肺损伤,并可能通过ECM-receptor interaction、Cytokine-cytokine receptor interaction、Focal adhesion、PI3K/Akt等信号通路发挥作用。

基于KEGG通路富集分析颗粒酶B-穿孔素选择性诱导胰腺炎时巨噬细胞凋亡的作用

目的:从分子水平探究颗粒酶B(GRB)-穿孔素(PFP)对选择性诱导胰腺炎时巨噬细胞凋亡的影响。方法:采用肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激人单核巨噬细胞系(TPH-1)模拟急性胰腺炎时巨噬细胞炎症反应,通过CCK8法筛选TNF-α、PFP、GRB的最适浓度;流式细胞仪分别检测对照组、TNF-α组、PFP+GRB组、TNF-α+PFP+GRB组的细胞凋亡情况。将细胞样本分为3组:正常细胞组(NC组)、TNF-α处理组(Treat1组)和TNF-α+PFP+GRB处理组(Treat2组)。提取3组细胞RNA进行转录组学分析,分别通过主成分分析、差异基因分析、富集分析检测各组基因表达情况;选取“细胞因子-细胞因子受体相互作用通路”中的7个差异表达基因(RAB37、GPA33、USH1C、SYTL1、MSRB3、GPER1和CD1B)应用荧光定量PCR验证转录组学分析的准确性。结果:Treat2组与Treat1及NC组相比,细胞凋亡比例显著升高(P<0.05);NC组与Treat1组、Treat2组的差异比较大,显著差异基因较多,而Treat1组与Treat2组的显著差异基因较少,但Treat2组比Treat1组相对于NC组的变化更大;富集分析显示差异基因主要富集于“细胞因子-细胞因子受体相互作用通路”;荧光定量PCR结果显示,所选取的7个差异基因与NC组相比明显下调(P<0.05),和转录组学结果趋势一致。结论:GRB-PFP可选择性诱导胰腺炎时巨噬细胞的凋亡,并作用于“细胞因子-细胞因子受体相互作用通路”,从而下调细胞因子表达,减轻炎症反应。

龙葵碱对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及机制研究

目的探讨龙葵碱对胰腺癌细胞SW1990裸鼠移植瘤的抑制作用并初步研究其作用机制。方法建立胰腺癌细胞SW1990的裸鼠荷瘤模型,随机分为对照组和实验组,每组10只。肿瘤接种成功第2周起对照组和实验组分别腹腔注射溶媒(含1‰二甲亚砜)1 mL、龙葵碱10 mg/kg,隔天给药1次,共给药2周。每次给药结束用游标卡尺记录肿瘤大小。给药结束后颈椎脱臼处死裸鼠,测量瘤体重量并计算抑瘤率,留取新鲜肿瘤组织用RT-PCR和免疫组化检测Bcl-2、Bax和Caspase-3基因mRNA和蛋白表达情况。结果与对照组相比,实验组裸鼠肿瘤生长受到显著抑制(P<0.05),实验组的肿瘤组织Bcl-2表达阳性率明显降低(实验组90%vs对照组46%,P<0.01),Bax(实验组38%vs对照组70%,P<0.01)和Caspase-3(实验组22%vs对照组74%,P<0.01)的表达阳性率明显升高。结论龙葵碱在裸鼠体内能显著抑制人胰腺癌细胞SW1990的增殖,此抑制作用呈明显的时间依赖性。龙葵碱发挥上述作用的机制可能在于诱导胰腺癌细胞凋亡。

一种新型大鼠胰腺去细胞化支架的制备研究

目的通过经胃左动脉途径灌注,选择胰腺体尾部作为灌注主体,应用各种去细胞化灌注技术,以制备新型天然胰腺去细胞化生物支架,并全面评价其理化特性,以期为胰腺组织再生工程的研究提供良好的应用载体。方法选择健康成年雄性SD大鼠,离体获取胰体尾部作为灌注主体,采用胃左动脉作为灌注入路,通过物理冻融、酶解法及曲亚通(TritonX-100)为主辅以十二烷基硫酸钠(SDS)的洗脱剂组合进行顺行灌注,获取胰腺去细胞支架。并通过大体形态观察、美兰染色、组织病理学观察、基因组DNA定量分析、电镜观察、胶原蛋白成分鉴定、免疫原性分析等对去细胞化后的胰腺支架进行全面的评价。结果本研究方法可成功制备肉眼透明的胰腺去细胞化支架,组织学检测和电镜观察均表明去细胞支架内无细胞残留,内部脉管网络和空间结构保存完整;免疫荧光分析表明去细胞化后支架的细胞外基质成分保留得较为完整,且支架DNA残留量为(42.3±10.6)ng/mg,不足正常胰腺的5%;皮下移植实验证实获得的去细胞化支架具有良好的组织相容性。结论以胰腺体尾部作为灌注主体,经胃左动脉途径灌注的策略能够成功制备一种新型的去细胞化胰腺支架,并且支架的基质成分和理化特性较完整地保留,能够为胰腺组织工程研究提供一种良好的载体选择。

脂氧素A4改善肺微血管内皮细胞炎症损伤的体外实验研究

目的观察脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)对肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)炎症损伤的治疗作用。方法体外培养人PMVECs,第一阶段:分为空白对照组(完全培养基培养)和TNF-α组(分别以5、10、20 ng/mL共培养24 h),采用MTT法检测各组PMVECs存活率,用针头式滤器检测TNF-α损伤前后PMVECs的单层通透性。第二阶段:分为TNF-α组(20 ng/mL处理24 h)和LXA4干预组(1、10、100μg/L处理24 h),检测PMVECs存活率和单层通透性,RT-PCR检测PMVECs IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA的表达。结果 (1)5、10、20 ng/mL TNF-α组的PMVECs存活率分别是(76.39±9.3)%、(61.87±11.7)%、(49.54±12.6)%,与空白对照组比较,均显著降低(P <0.05),而经1、10、100μg/L三种浓度LXA4干预后,20 ng/mL TNF-α组的PMVECs存活率均得到提高,其中100μg/L LXA4干预后的PMVECs存活率为(82.32±8.7)%,有统计学差异(P <0.01);(2)与损伤前[(0.021±0.011)mL/min·cm^2·kPa]比较,TNF-α处理60、90min后PMVECs单层通透系数(Kf值)显著增高[(0.067±0.007)和(0.096±0.007)mL/min·cm^2·kPa,P <0.05)],而LXA4干预60、90 min时Kf值则显著降低[(0.039±0.008)和(0.058±0.011) mL/min·cm^2·kPa,P <0.05)];(3)与对照组比较,TNF-α组的IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA的表达水平均有显著升高(P <0.01或P <0.05),而LXA4干预组显著改善(P <0.01或P <0.05)。结论 TNF-α能引起PMVECs的急性炎症损伤,LXA4对TNF-α引起的PMVECs急性炎症损伤有改善作用。