蜜蜂表皮蛋白apidermin(apd)基因家族3个新成员的特性鉴定及昆虫APD家族序列特征的分析

Apidermin(APD)蛋白家族是一个新的昆虫结构性表皮蛋白家族。本研究结合生物信息学和RT-PCR扩增,对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称"意蜂")的apd-1-like,apd-3-like和中华蜜蜂Apis cerena cerena(简称"中蜂")的apd-2等3个新的apd基因的结构特征和表达进行了分析,并分析了昆虫APD蛋白家族的序列特征。结果显示,在西方蜜蜂Apis mellifera(简称"西蜂")中,apd基因家族的6个成员串联排列在基因组序列第4号连锁群上,它们在A.m.ligustica雄蜂头部中的转录水平差异明显,且其启动子序列所含顺式元件也不同。中蜂apd-2和意蜂apd-1-like都含有3个外显子和2个内含子,而意蜂apd-3-like则由4个外显子和3个内含子组成。蛋白序列分析结果显示,目前已知的10条APD蛋白序列N末端均具有相似的信号肽序列,其成熟蛋白分子量为6.0～37.0kD,pI为6.2～10.8。其中西蜂的APD1-3、APD-like和东方蜜蜂Apiscerena的APD-2等5条较短的多肽中疏水氨基酸残基达52%～67%,且Ala含量最为丰富(占25%～34%);而丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis的APD1-3和西蜂APD-1-like,APD-3-like等另外5条APD多肽富含Gly(21%～30%),其序列中疏水氨基酸残基含量为35%～41%。多肽序列多重比对和系统进化分析结果显示,APD家族可划分为2个亚家族。亚家族Ⅰ含有西蜂APD1-3和东方蜜蜂APD-2等4条较短的多肽序列,其N末端为一个长33aa的保守基序;亚家族Ⅱ由另外6条相对较长的多肽序列组成,其N末端保守基序长50aa,C末端保守基序长16aa。本文所描述的APD蛋白家族序列特征有助于以后从其他昆虫中鉴定新的apd基因。

西方蜜蜂表皮蛋白基因apd-like转录起始位点的定位及cDNA序列的分析

Apidermin蛋白家族是根据蜜蜂表皮蛋白apidermin1-3(APD1-3)而命名的一个新型的昆虫结构性表皮蛋白家族。为了鉴定西方蜜蜂Apis mellifera基因组序列上毗邻基因簇apd1-3的一个预测基因座LOC727145是否为一个新的apd基因,本研究在用5′LongSAGE标签定位该基因的转录起始位点(TSS)的基础上,利用其中的3条5′LongSAGE标签序列作为上游引物,通过RT-PCR方法克隆了该基因的cDNA序列(GenBank登录号:GU358197,GU358199,GU358198)。生物信息学分析发现,基因座LOC727145含有2个外显子和1个"GT-AG"型内含子,其cDNA序列富含GC(70%),可编码一条长152aa残基的高度疏水性多肽。此多肽序列的氨基酸组成与蜜蜂APD1-3表皮蛋白类似,富含Ala,Gly,Pro,Leu和Val5种氨基酸(占77%),其中Ala残基含量最高(29%)。该多肽序列与蜜蜂APD-1表皮蛋白序列的相似性为50%,且其N末端的预测信号肽序列与APD蛋白的信号肽序列类似。5′LongSAGE标签的基因组定位结果显示,基因座LOC727145在雄蜂头部中表达丰度很高,RNA PolⅡ可从6个不同的TSS上以不同效率起始转录,其中由一个优势TSS上起始了90%的转录。本研究为apidermin表皮蛋白家族增添了一个新成员,命名为apidermin-like(apd-like)。

cDNA微阵列检测萌发期水稻重要代谢基因表达模式

使用含 2 2 0 0条水稻表达序列标签的 c DNA微阵列检测了萌发期水稻胚芽、胚轴 (含糊粉层和盾片 )、胚根的基因表达模式 ,得到 10 32个有效的基因表达数据。其中 ,在胚芽、胚根、胚轴中特异表达的基因数分别为 5 5、10 6和 36个。以胚轴为参比 ,70个基因在胚芽、胚根中均表达上调 ,包括延伸因子 1和多个核糖体蛋白基因 ,这些基因与顶端生长点的细胞分化和生长有关。胚轴特异表达的基因有 36个 ,大部分参与胚乳贮藏物质的代谢 ,如聚泛蛋白基因。

四个意大利蜜蜂品系RAPD遗传标记的分析

前期研究中筛选到可在平湖浆蜂 (Ep)、美意 (Em)、澳意 (Eo)和苏意 (Es)中扩增出多态性条带的RAPD -PCR随机引物W18(5’ -CGGACGGCGG - 3’)和W2 3(5’ -GTACCGCCCG - 3’)。本文以群体遗传学方法对这 4个意蜂品系的RAPD多态性扩增条带进行分析。分析结果表明 ,在引物W18扩增出的多态性条带中 ,2 35 2bp和 36 4bp条带仅在美意中检测到 ,其基因频率分别为 0 .0 5 5 9和 0 .0 4 2 0 ;6 32bp条带在平湖浆蜂中出现的基因频率 (0 .90 86 )远高于美意 (0 .0 36 3)、澳意 (0 .0 190 )和苏意 (0 .0 0 0 0 ) ;2 0 92bp条带在美意与澳意中出现的基因频率分别为 0 .0 2 2 3和 0 .0 6 6 7,而在苏意和平湖浆蜂未检测到该条带。在W2 3引物扩增条带中 ,仅在澳意中检测到 6 5 1bp条带 ,其基因频率为 0 .0 348。RAPD多态性扩增条带基因频率的聚类分析结果表明 ,平湖浆蜂与苏意的亲缘关系最近 ,其遗传相关系数为 0 .982 0 ;平湖浆蜂、苏意与美意的遗传系数均为 0 .970 0 ,而与澳意的遗传相关系数均为 0 .96 90 ,表明这两个地方蜂种与美意的亲缘关系略高于澳意。美意与澳意的亲缘关系相对较远 ,其遗传相关系数为 0 .96 90。本研究结果在鉴定意蜂地理亚种下的各品系中具有实际应用价值。

以冻融法快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的 pTaq表达质粒转化E .coliDH5α菌株 ,IPTG诱导表达TaqDNA聚合酶。利用该酶的热稳定性 ,反复 2次 - 70℃、75℃交替冻融以裂解细胞释放胞浆 ;以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化TaqDNA聚合酶的目的。PCR扩增反应和SDS -PAGE分析表明所制备的TaqDNA聚合酶的纯度、活力、敏感性、特异性均达到试验要求。该方法具有快速简便的优点。

快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的 pTaq表达质粒转化E .coliDH5α菌株 ,IPTG诱导表达TaqDNA聚合酶 .利用该酶的热稳定性 ,经两轮 - 70℃深度冷冻和 75℃水浴 ,细菌裂解释放内容物 ,以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化TaqDNA聚合酶的目的 .PCR扩增反应表明所制备的TaqDNA聚合酶的活力、敏感性、特异性均达到试验要求 .该方法具有快速简便的优点 .

表达序列标记(EST)研究进展

表达序列标记 (EST)是通过对cDNA文库克隆进行大规模测序所获得的 5′或 3′端序列 ,长度一般为 30 0～ 5 0 0bp ,可代表生物体某一时间内某组织中表达的基因 .本文就EST技术原理、概念最新发展及其在大规模快速克隆基因。

以随机扩增多态性DNA(RAPD)技术筛选意大利蜜蜂重要农艺性状遗传标记

为了获得意大利蜜蜂重要农艺性状的分子遗传标记 ,本研究以 30种RAPD随机引物对平湖浆蜂、美意、澳意、苏意等 4个在产浆、采蜜和抗病性上存在较大差异的意蜂品系的基因组DNA进行RAPD_PCR扩增筛选。试验结果显示 ,随机引物W 1 8(5′_CGGACGGCGG_3′)和W2 3(5′_GTACCGCCCG_3′)的扩增图谱呈多态性。其中 ,在引物W 1 8所扩增出的 9条片断中 ,2 35 2bp和 36 4bp条带为美意所特有 ,表明可将之用于鉴别美意 ;2 0 92bp条带仅出现于蜂蜜高产的美意和澳意中 ,意味着该条带为一个蜂蜜高产性状的遗传标记 ;而 6 32bp条带在王浆高产品系平湖浆蜂中出现的频率 (0 91 )显著高于 (P <0 0 1 )美意(0 0 4 )、澳意 (0 0 2 )和苏意 (0 0 0 ) ,说明 6 32bp条带可能为王浆高产性状的一个遗传标记。在W2 3引物扩增条带中 ,6 5 1bp条带为澳意所特有 。

以cDNA微阵列检测 313个已知基因在萌发期水稻幼苗中的表达谱(英文)

使用含 5 12个已知水稻基因 3′表达序列标签的cDNA微阵列检测了萌发期水稻幼苗的基因表达谱 .3 13个基因产生了可靠的杂交信号 .其中 ,天冬氨酸氨基转移酶基因和 4个具有核糖体功能的基因表达丰度非常高 ,表明萌发期幼苗中的氨基酸和蛋白质的合成代谢很活跃 .β -1,3 -葡聚糖酶基因是一种典型的病程相关基因 ,该基因的高水平表达 ,表明幼苗中存在着一种高度发育的抗病机制 .实验也发现编码一种重要的抑制细胞凋亡的基因 -Baxinhibitor -1,在幼苗中的表达丰度很高 ;该结果可解释为什么正常的幼苗中很少发生细胞程序性死亡现象 .

EST技术在植物基因克隆和基因表达谱研究中的应用

表达序列标签是cDNA的部分序列 ,是通过对cDNA文库进行大规模一次性测序而获得 .对于植物研究而言 ,该技术已成为一种高效、经济的克隆重要植物基因的工具 .而且 ,通过分析来自特定组织的EST库可以定量地估计该组织中各类基因的表达丰度 .这种组织基因表达谱可用于阐明植物的代谢调控网络或植物对生物、非生物胁迫反应的信号转导途径 .文章以几个典型的实例阐释如何利用EST技术来克隆重要的植物经济性状基因及以此技术进行表达谱研究 .

饲喂蜂王浆对果蝇繁殖力影响的研究

在果蝇羽化至性成熟期间补饲不同剂量的蜂王浆,研究了蜂王浆对果蝇繁殖力的影响。结果表明,补饲蜂王浆可极显著提高雌果蝇的繁殖力,其F1代成蛹数最高可比对照组高158%;而王浆对雄果蝇的繁殖力影响不明显。试验还发现,王浆对果蝇繁殖力的影响主要发生在雌性果蝇的性发育阶段。

用5'LongSAGE标签产生的长cDNA片段分析西方蜜蜂(Apis mellifera)基因座LOC727225的选择性剪接

选择性剪接是真核生物产生蛋白多样性的一个重要机制,并能通过产生不同的剪接本来调节基因在不同组织或发育阶段的表达而发挥其作用。本研究采用3条5'LongSAGE标签序列作为上游引物,通过RT-PCR克隆了西方蜜蜂(Apis mellifera)的一个预测基因座LOC727225的4条cDNA序列(GenBank登录号:JN627500至JN627503)。将cDNA序列对蜜蜂基因组作图发现,雄蜂头部中该基因的mRNA前体经由两种不同的剪接方式产生的2个长度不同的剪接本,其中较短的剪接本编码一个功能未知的新蛋白,而较大剪接本的推导产物蛋白与分支酸合酶和神经胰蛋白酶具有序列相似性。5'LongSAGE标签数据显示,LOC727225在成年雄蜂头部的表达水平非常高,RNA PolⅡ可从该基因的6个不同的转录起始位点(TSS)上以不同效率起始转录,其中在2个优势TSS上所起始的pre-mRNA被剪接成较小的剪接本,其数量占该基因成熟mRNA分子总量的90%。启动子序列分析显示,LOC727225是受细胞周期转录因子E2F和StuAP调控的靶基因,该基因可能在蜜蜂的细胞增殖中起重要作用。研究首次证实了基因座LOC727225的选择性剪接和选择性起始,结果为深入探索该基因的功能奠定了基础。

四个意大利蜜蜂品系苹果酸脱氢酶Ⅱ基因的遗传差异分析

研究了意大利蜜蜂(A.m.ligustica)4个王浆、蜂蜜生产性能不同品系—美意(Em)、澳意(Eo)、苏意(Es)和平湖浆蜂(Ep)的MDHⅡ同工酶基因型频率、基因频率及杂合纯合度.试验发现,MDHⅡ的a、b、c三个等位基因在4个品系中出现的频率不同.c在Em、Eo、Es和Ep中的基因频率分别为0.507、0.483、0.680和0.820,为优势等位基因.该结果表明在产浆性能高的品系中c基因频率较高,意味着可将c基因频率作为意蜂王浆产量性能的一个遗传标记.等位基因a在Em、Eo、Es和Ep中频率分别为0.323、0.263、0.193和0.087;在Em中出现的频率最高.而等位基因b在Eo中频率(0.253)高于其他3个品系(Em,0.170; Es,0.127;Ep,0.093).Ep的纯合度最高,达0.753,高于Em(0.533)、Eo(0.633)和Es(0.540).经独立性检验,4个意蜂品系MDHⅡ同工酶的基因型频率、基因频率、纯合度均达到极显著差异水平.

用5’LongSAGE标签分析蜜蜂Yps基因转录起始位点的多样性

使用5’LongSAGE标签序列确定了一个新的西方蜜蜂Ypsilon Schachtel(Yps)基因的转录起始位点,并进而预测了该基因的启动子序列.5’LongSAGE标签的蜜蜂基因组定位结果表明:在成年雄蜂的头部中,蜜蜂Yps基因存在23个转录起始位点,其中优势转录起始位点有4个,其起始频率分别为27.9%、23.1%、13.5%和11.5%.Yps基因TSS的碱基组成分析发现,此23个TSS第一个碱基为A、G、T、C的概率分别为52%、39%、4%、4%.这些结果暗示RNA聚合酶和调控因子在Yps基因启动子的一个较宽范围内的互作控制着不同转录本的起始效率.

西文蜜蜂LOC724521基因座的cDNA序列克隆及TSS的分析

5’LongSAGE标签得自于全长mRNA分子的5’末端的前19 nt.该研究利用定位在西方蜜蜂基因组中的一个预测基因座LOC724521的2条5’LongSAGE标签序列作为5’引物,通过RT-PCR克隆了该预测基因座的2条长335 bp和337 bp的cDNA序列(GenBank登录号:GU358205,GU358204).此cDNA编码一条长88个氨基酸残基的多肽.用所克隆的cDNA序列对基因座LOC724521进行功能注释发现,该基因含有3个外显子和2个"GT-AG"型内含子.5’LongSAGE标签序列的基因组定位结果显示:基因座LOC724521在雄蜂的头部中表达丰度很高,RNA PolⅡ可从5个转录起始位点(TSS)上以不同效率起始转录,该基因的59%和31%的转录是从2个优势TSS上起始.有趣的是,有一条5’LongSAGE标签序列被定位在内含子区,暗示该基因存在外显子的可变性选择现象.该研究结果不仅在转录水平上证实了软件预测的基因座LOC724521确实存在,同时揭示了该基因存在可变性转录起始位点和可变性外显子选择等转录调控机制.

羽速性状对番鸭生活力和繁殖性能的影响

快、慢羽番鸭育雏率和产蛋期存活率差异不显著 (p>0 .0 5) ,但慢羽公番鸭育成率 (1 0 0 % )显著 (p<0 .0 5)高于快羽公番鸭 (83.33% ) .快慢羽母番鸭性成熟日龄分别为1 67和 1 64日 ;快、慢羽组 1 2产蛋周平均日产蛋率分别为 33.2 3%和 46.93% ,二者差异显著 (p<0 .0 5) ;两种羽型番鸭种蛋受精率、孵化率均无显著性差异 (p>0 .0 5)

发育中水稻种子淀粉合成分子机制的研究

对GenBank中9215条来源于水稻(OryzasativaL.ssp.Indica)胚乳cDNA文库的3'EST进行了分析,获得20个淀粉合成相关基因的表达丰度信息.研究发现淀粉合成的5个关键酶的编码基因,ADPG焦磷酸化酶基因、ADP-葡萄糖淀粉合成酶、淀粉分支酶、淀粉去分支酶、蜡质基因的表达丰度极高,表明该时期水稻胚乳内淀粉合成反应非常强烈.研究发现在淀粉合成途径中存在功能相关的基因协同表达的现象.文章结合所获得的基因表达信息对淀粉合成的分子机理进行了探讨.

水稻幼苗SAGE文库的构建和测序

基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)是功能基因组学研究中的一项功能强大的工具.对水稻幼苗SAGE文库的构建进行了探索试验,其主要操作步骤为:以磁珠法提取PolyA mRNA用于合成双链cDNA,再经过一系列的酶切、加接头序列、连接、PCR扩增,获得到26-bp的水稻双标签体,再将26-bp Ditag连接成标签链接体,并将其克隆进pZero-1载体中用于测序.DNA测序结果证明获得了水稻的SAGE标签.试验的各个中间步骤的结果均经过PCR验证.

中华蜜蜂精子介导egfp基因转移

中华蜜蜂Apis cerana cerana是一种真社会性昆虫，也是我国重要的经济昆虫。本实验目的是为了检测精子是否可以作为载体将外源egfp基因介导转入中华蜜蜂。首先将雄蜂精子与线性化的质粒DNA共浴，然后通过人工授精技术将精子导入处女王，再对实验蜂群后代进行分析。结果显示EGFP蛋白在一群实验组蜂的1～2日龄小幼虫中表达较强，能检测到0．01％～0．02％荧光阳性小幼虫个体；通过PCR和RT—PCR技术分析，证实转入的外源egfp基因获得表达。实验结果表明精子载体法能够用于中华蜜蜂外源基因的转移和表达。

中华蜜蜂急造王台的工蜂亲属优惠

人为使3群中华蜜蜂(Apis cerana cerana)失王而出现急造王台后,应用3个蜜蜂微卫星位点A14、A107和B124对蜂群、急造王台中的幼虫及其哺育蜂的亚家庭进行鉴别,以此来研究中华蜜蜂急造王台的工蜂亲属优惠。结果显示:在3个实验蜂群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别检测到11、13和14个亚家庭,各蜂群各亚家庭之间的工蜂分布差异不显著。然而各蜂群中急造王台却分别只出现在少数的3、4和5个亚家庭中,各亚家庭之间在王台出现率上存在极显著的差异。另外,各急造王台的所有哺育蜂并非只来自幼虫所在的亚家庭,而是分布在更多的亚家庭里,并且各亚家庭之间差异不显著。以上结果证明:中华蜜蜂急造王台时,在蜂王幼虫的选择过程中存在工蜂亲属优惠行为,但蜂王幼虫与它们的哺育工蜂之间并不存在工蜂亲属优惠。