青岛地区规模化兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性研究

为了解青岛地区产气荚膜梭菌流行株近几年出现的毒素型、遗传多样性和耐药性变化,本研究选取2006年和2012年从青岛规模化兔场分离的产气荚膜梭菌菌株各15株,分别采用多重PCR、ERIC-PCR和药敏纸片法对分离菌株的毒素型、遗传多样性和耐药性进行检测。结果表明:2006年分离的产气荚膜梭菌流行株均为A型,β2毒素阳性菌为2株(13.33%),而未检测到肠毒素和NetB毒素;2012年分离的15株产气荚膜梭菌流行株中A型14株、C型1株,β2毒素阳性菌为6株(40%),同样未检测到肠毒素和NetB毒素。将30株产气荚膜梭菌流行株通过ERIC-PCR方法分为14个亚型,其中2006年分离株分布于8个亚型,V型为主要流行型;2012年分离株也分布于其中8个亚型,主要流行型为Ⅲ型和Ⅺ型。产气荚膜梭菌2012年流行株比2006年流行株对先锋霉素、强力霉素、万古霉素、青霉素的耐药率大幅度提高。本研究结果显示:自2006年以来,青岛规模化兔场产气荚膜梭菌流行株在毒素基因、遗传多样性和耐药性上均发生了较大变化,这一结果为今后该地区兔场产气荚膜梭菌病的防控提供了依据。

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbs）为基础，建立检测膦丝菌素乙酰转移酶（the phosphinothricin acetyltransferase,PAT）的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因（blalaphos resistance gene）bar，并与表达载体pET28a构建重组质粒，诱导表达产生外源性PAT蛋白；以纯化后的PAT蛋白为免疫原，制备mAbs，建立双抗体夹心ELISA方法，并与PCR检测方法进行比较，确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其有效检测范围为3.125～50 ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测，根据阴阳性判定值OD450〉0.210，检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份，以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份，2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法，可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。

一株羊产气荚膜梭菌的分离鉴定

山东某一羊场2岁羊只急性死亡,疑似产气荚膜梭菌感染。为明确发病原因,从病料中分离病原菌,通过镜检、生化试验、PCR检测等对分离菌株进行鉴定,并进行动物回归实验。实验结果显示:分离株为革兰阳性杆菌,生长特性及生化特性与产气荚膜梭菌一致,PCR鉴定为同时含有α毒素和β毒素,攻毒组小鼠全部死亡。表明该分离菌为C型产气荚膜梭菌,且对小鼠具有较强致病性。

产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

为了对产气荚膜梭菌α毒素进行快速、有效的检测,本研究以单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)为基础,建立了双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)方法。纯化原核表达的α毒素蛋白为免疫原,制备腹水型mAb并分离纯化作为检测抗体,免疫新西兰大白兔制备抗α毒素多克隆抗体纯化后作为捕获抗体,通过试验优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。DAS-ELISA方法对α毒素的有效检测范围为5.86~375μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A^E型产气荚膜梭菌标准菌株的培养上清中,α毒素含量差异较大,A型菌(NCTC528)中α毒素含量显著高于其他菌型。本研究成功制备了高特异性的mAb,并建立了特异、灵敏、稳定的DAS-ELISA方法,为高效检测α毒素提供了有效工具。

青岛地区兔源产气荚膜梭菌的分离鉴定及遗传多样性分析

兔的梭菌性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的严重危害养兔业的一种疾病,为了更好地控制此病,本研究调查了青岛地区规模化兔场爆发此病时产气荚膜梭菌的毒素型及遗传多样性。2010年11月-2012年5月期间,采集青岛地区规模化养兔场疑似产气荚膜梭菌感染兔的肝脏进行产气荚膜梭菌的分离鉴定,采用Multiple-PCR方法对分离菌株进行毒素型分析,应用ERIC-PCR方法分析分离菌株的遗传多样性。共分离到25株产气荚膜梭菌,其中A型24株(96%),C型1株(4%)。用ERIC-PCR方法将25株分离株分于9个聚类中,其中Ⅴ型为主要流行型。结果表明:青岛地区规模化兔场中产气荚膜梭菌流行的毒素型主要为A型,且具有多种基因亚型,其中Ⅴ型为主要流行型。此结果为该地区兔产气荚膜梭菌病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。

长毛兔巴氏杆菌病的诊断与治疗

由于受到天气及饲养管理环境等因素的影响,导致兔巴氏杆菌病多发,且发病率和死亡率较高,对养兔业危害很大。因此,本文探究长毛兔巴氏杆菌病的诊断与治疗方案,结合具体病例情况,进行临床诊断及实验室确诊,最终总结出长毛兔巴氏杆菌病的最佳治疗方案。希望通过本文的研究,可以为我国长毛兔巴氏杆菌病的治疗提出借鉴意义,进而保障我国兔业的持续健康发展。

兔大肠杆菌耐药性的初步调查研究

为对滨州市地区兔大肠杆菌的耐药性情况进行初步调查,本研究分离鉴定多家兔场大肠杆菌,并进行了生化鉴定试验和药敏试验。共分离鉴定出兔大肠杆菌35株,生化试验结果显示,兔大肠杆菌可分解葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖,M.R试验阳性,V.P试验、氧化酶和过氧化氢酶试验阴性,不液化明胶;27种常用药物的药敏试验结果显示,28(80%)株菌株产生多重耐药性,对头孢曲松的敏感率(92.6%)最高,对头孢哌酮、卡那霉素、新霉素、头孢拉定、氟苯尼考、利福平、头孢氨苄和磷霉素的敏感率依次为:69%、53%、48%、31%、16%、11%、8%、8%。本研究对滨州市多家兔场兔大肠杆菌的耐药种类进行初步的调查,为今后兔场大肠杆菌的防控和治疗提供了前期数据和科学的方法。

一例獭兔多杀性巴氏杆菌与魏氏梭菌混合感染的诊治

兔巴氏杆菌病(Pasteurellosis)又名出血性败血症,是由多杀性巴氏杆菌引起的一种多型性、散发性或地方流行性、细菌性传染病[1]。由于病菌的毒力、感染途径以及病程长短不同,其临床症状和病理变化也不同。主要有全身败血病、传染性鼻炎、地方流行性肺炎、结膜炎、中耳炎、生殖器官感染和脓肿[2]。家兔对多杀性巴氏杆菌十分敏感,发病率高达60%以上,若不及时采取有效措施,易引起大量发病和死亡,随着养兔生产高度集约化,本病发生呈上升趋势,另外由该病引发兔只死亡、生长缓慢、饲料报酬降低及药物防治费用增加等,给养兔业造成了严重经济损失,应引起广大养殖户及有关部门的足够重视。