猪传染性胃肠炎病毒Nsp2与宿主细胞蛋白PSMD11相互作用的研究

为确定猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)非结构蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11(PSMD11)之间是否存在相互作用,本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因,并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11,经测序和双酶切验证正确后,转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀(Co-IP)试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用,并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示,本研究成功扩增了猪源PSMD11基因,大小约为1474 bp,基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白;Co-IP结果表明,PSMD11与Nsp2之间存在相互作用;共定位试验结果显示,PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中,且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。

宿主细胞蛋白HSPA2与TGEV Nsp2的相互作用及其对病毒复制的影响

为了探究猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)非结构蛋白2(Nsp2)与宿主细胞热休克蛋白70-2(HSPA2)的相互作用,以及HSPA2表达对TGEV复制的影响,试验利用RT-PCR方法获得猪源HSPA2基因并构建其真核表达载体pCMV-Myc-HSPA2,通过Western-blot和间接免疫荧光试验检测真核表达载体pCMV-Myc-HSPA2在IPEC-J2细胞中的表达情况。利用免疫共沉淀(Co-IP)和共定位试验进一步验证TGEV Nsp2和宿主细胞蛋白HSPA2之间是否存在相互作用,利用基因过表达技术在IPEC-J2细胞中过表达HSPA2后接种TGEV,分别测定接种后36,48小时时病毒TCID50。结果表明:真核表达载体pCMV-Myc-HSPA2能够在IPEC-J2细胞中成功表达,HSPA2与Nsp2之间存在相互作用,并且HSPA2表达量升高后TGEV的TCID50略有升高。说明宿主细胞蛋白HSPA2与TGEV Nsp2之间存在相互作用,且HSPA2的表达对TGEV复制具有一定促进作用。