慢病毒介导SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型建立

背景:沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)基因是一个与衰老关系密切的基因,可以通过调节PI3K/AKT、NF-κB等信号通路影响到组织及机体的衰老过程,并参与骨科相关疾病的发生发展。建立慢病毒介导的SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型,可以为研究SIRT1基因相关的骨科系统疾病如骨关节炎、骨质疏松症等提供实验基础。目的:构建携带小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒载体,将其转染ATDC5细胞系,建立SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型。方法:根据RNAi序列设计原则设计并合成SIRT1基因的RNAi靶点序列,连接GV248(框架结构:h U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)载体,转化后经阳性克隆测序及PCR鉴定,质粒抽提后导入293T细胞,包装慢病毒,取上清检测滴度。将含有小鼠SIRT1基因RNAi的病毒颗粒转染ATDC5细胞系,并于荧光显微镜下进行观察,行RT-PCR检测ATDC5细胞中SIRT1 m RNA的表达情况。结果:经测序、PCR检测可知,SIRT1基因的RNAi靶点序列与GV248载体连接成功,并包装成高滴度的慢病毒。携带小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒感染ATDC5细胞后,荧光显微镜下观察显示感染率较高,RT-PCR检测发现,携带SIRT1基因的慢病毒感染组SIRT1基因m RNA的相对表达量为0.386±0.117,与阴性对照病毒感染组相比有统计学差异(P<0.05),敲减效率为61.4%。结论:成功建立SIRT1基因表达降低的ATDC5细胞模型,为研究SIRT1基因相关骨科系统疾病提供实验基础。

沉默信息调节因子1基因对软骨细胞胞外基质影响的体外研究

背景:沉默信息调节因子1(sirtuin type 1,Sirt1)基因与骨关节炎有密切联系,但其具体作用机制尚不明确。目的:探讨Sirt1基因对软骨细胞胞外基质的影响及其具体的表现形式。方法:体外分离并培养小鼠的膝关节软骨细胞,通过甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色等方法鉴定软骨细胞。根据实验设计加入不同的作用物质而将实验分为3组:空白对照组,EX-527组(Sirt1基因的抑制剂,终浓度为1 mmol/L)和白藜芦醇组(Sirt1基因的激动剂,终浓度为100μmol/L)。RT-PCR检测Sirt1基因,软骨细胞外基质特异性合成基因Sox9、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖及软骨细胞外基质特异性降解基因MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的m RNA表达水平。结果:免疫荧光染色检测显示,Ⅱ型胶原染色阳性细胞数占90%以上,表明培养细胞为软骨细胞。与空白对照组比较,白藜芦醇组中Sirt1基因m RNA表达明显上调,Sox9、聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的m RNA表达显著增加,MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的m RNA表达显著减少(P<0.05);EX-527组中Sirt1基因m RNA表达明显下降,Sox9、聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原的m RNA表达显著减少,MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的m RNA表达显著增加(P<0.05)。结论:Sirt1基因能够对软骨细胞胞外基质产生影响,且Sirt1的表达可以促进软骨细胞胞外基质的合成并且减缓软骨细胞胞外基质的降解。

β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合对人间充质干细胞早期成软骨分化作用的实验研究

背景:β-catenin基因抑制人间充质干细胞(hMSCs)成软骨分化,而Sox9基因促进hMSCs成软骨分化,但两者联合在hMSCs早期成软骨分化中的作用及其可能机制目前尚不明确。目的:探究β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合对hMSCs早期成软骨分化的作用。方法:将骨髓来源hMSCs分为4组:阴性对照组,β-catenin基因敲减组,Sox9过表达组,β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合组,加入成软骨分化培养基培养7 d。转染24 h,RT-PCR检测β-catenin基因敲减效率与Sox9过表达效率,RT-PCR检测COL2A1和ACAN的m RNA表达量,番红固绿染色、甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学检测COL2A1和Aggrecan蛋白。结果:RT-PCR结果显示转染成功,β-catenin基因敲减效率与Sox9过表达效率较高(P<0.05)。β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合组中COL2A1和ACAN的mRNA表达量显著高于其他3组(P<0.05),软骨成分染色更深(P<0.05)。免疫组化结果显示β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合组的COL2A1和Aggrecan蛋白表达量显著高于其他3组(P<0.05)。结论:β-catenin基因敲减与Sox9过表达联合对hMSCs早期成软骨分化有促进作用。

自噬在大鼠椎间盘软骨终板退变中的作用

背景:椎间盘退变引起的下腰痛是导致老年人瘫痪的主要原因,但是有关椎间盘退变的机制仍未完全明确。自噬可能在椎间盘退变过程中起重要作用。目的:研究自噬对大鼠腰椎间盘软骨终板细胞Ⅱ型胶原纤维α1(COL2A1)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)分泌的影响。方法:将细胞分为对照组、巴弗洛霉素(Baf)组、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、TNF-α+Baf组4组,其中对照组、Baf组、TNF-α组分别采用二甲基亚砜、Baf、TNF-α作用于细胞24 h,TNF-α+Baf组先用Baf阻断自噬,再用TNF-α作用于细胞24 h。分别通过实时定量荧光聚合酶链反应、蛋白质印迹法、细胞免疫荧光染色等方法检测各组COL2A1、aggrecan mRNA和蛋白的表达并进行比较。结果:Baf组、TNF-α组和TNF-α+Baf组COL2A1、aggrecan mRNA和蛋白表达量均较对照组减少,且差异均有统计学意义(P均<0.05);TNF-α+Baf组COL2A1、aggrecan mRNA和蛋白表达量均较Baf组、TNF-α组减少,且差异均有统计学意义(P均<0.05);Baf组与TNF-α组COL2A1、aggrecan mRNA和蛋白表达量差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论:自噬对大鼠腰椎间盘软骨终板细胞分泌的COL2A1和aggrecan具有保护作用。

白藜芦醇激活PI3K/Akt信号通路对软骨细胞细胞外基质合成的影响

[目的]通过白藜芦醇刺激体外培养的小鼠膝关节软骨细胞,探讨白藜芦醇通过PI3K/Akt信号通路对软骨细胞细胞外基质合成的影响。[方法]体外分离培养小鼠膝关节软骨细胞,采用HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察鉴定软骨细胞。根据作用药物的不同分为3组:空白对照组、白藜芦醇组(100μmol/L白藜芦醇)和LY294002组(100μmol/L白藜芦醇+25μmol/L LY294002)。采用RT-PCR检测软骨细胞中Akt1,Aggrecan、Collagen II的m RNA表达水平。[结果]荧光显微镜下可见软骨细胞胞核呈蓝色荧光,胞质呈红色荧光。显示Ⅱ型胶原染色阳性细胞数占90%以上,证实所培养细胞为软骨细胞。RT-PCR检测结果显示白藜芦醇组Akt1、Aggrecan、Collagen II m RNA表达量较空白组明显升高(P<0.05)。LY294002组Akt1、Aggrecan、Collagen II m RNA表达量较白藜芦醇组下降,但仍高于空白组(P<0.05)。[结论]白藜芦醇可以通过激活PI3K/Akt信号通路,增加软骨细胞细胞外基质合成,起到保护关节软骨的作用。