巨噬细胞诱导型C型凝集素参与尿毒症微炎症状态及机制

目的探讨巨噬细胞诱导型C型凝集素(macrophage-inducible C-type lectin,Mincle)参与尿毒症微炎症状态的机制。方法SD大鼠随机分为假手术组和5/6肾切除手术建立的尿毒症组。检测肠道组织形态及通透性;透射电子显微镜观察肠道组织及肠巨噬细胞形态;免疫组化法检测肠组织切片中Mincle的表达;Western blotting检测巨噬细胞表面的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和NF-κB蛋白的表达。分离出血浆后,用鲎试剂动态浊度定量检测法检测血中内毒素,散射免疫比浊法检测C反应蛋白(C reactive protein,CRP),酶联免疫吸附法检测白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,并进行统计学分析。结果尿毒症组空肠、回肠、结肠Mincle表达高于假手术组(P<0.05);尿毒症组的回肠、空肠、结肠TLR4、NF-κB蛋白表达差异有统计学意义(P均<0.001);尿毒症组血中的内毒素、CRP、IL-6、TNF-α水平较假手术组显著增加(P<0.05)。结论尿毒症时肠道巨噬细胞表面的Mincle增高并进一步通过TLR4/NF-κB通路介导肠道巨噬细胞向M1型转化,释放炎症产物引起全身微炎症状态。

杂合血液净化技术在心脏手术后的疗效观察

目的探讨杂合血液净化技术在心脏手术后的临床疗效。方法选取半量血浆置换+双重血浆分子吸附+连续静脉-静脉血液滤过治疗施行体外循环心脏手术后患者,观察治疗前后血尿素氮、血肌酐(serum creatinine,Scr)、肝酶、胆红素、C反应蛋白(C reactive protein,CRP)等的变化情况,及随访治疗后3个月、6个月、1年的肝功能、肾功能及存活率。结果本研究最终纳入15例患者,共计28次治疗;杂合血液净化第2次治疗后96h Scr、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)与术前比较,差异均无统计学意义(P>0.05);第2次治疗后0h总胆红素(total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、间接胆红素(indirect bilirubin,IBIL)、降钙素原(procalcitonin,PCT)、CRP与术前比较差异均无统计学意义(P>0.05);血小板治疗后持续降低;治疗后1年,患者存活率为80%。结论心脏手术后多脏器衰竭的患者应用杂合血液净化技术较理想,可以有效提高患者的生存率。

超声下经皮腔内血管成形术治疗自体动静脉内瘘成熟不良

目的:分析超声下经皮腔内血管成形术(PTA)治疗自体动静脉内瘘(AVF)成熟不良的临床效果。方法:选取2018年9月至2022年4月在西安交通大学第一附属医院行超声下动静脉内瘘PTA治疗AVF成熟不良的患者,收集基线资料和术前、术后临床资料,观察手术成功率及手术并发症,并用Kaplan-Meier法分析AVF的初级和次级通畅率。结果:408例患者共行722例次PTA,其中AVF成熟不良患者87例。PTA技术成功率和临床成功率分别为98.9%和93.1%,术中、术后无严重并发症。术后AVF中位初次穿刺时间为13(4~21)d。6月、12月和24月AVF的初级通畅率分别为70%、65%和49%,次级通畅率分别为100%、98%和87%。结论:超声下PTA的手术成功率和通畅率均较高,是治疗AVF成熟不良的重要手段。

罗沙司他替代大剂量重组人红细胞生成素治疗维持性血液透析患者贫血的疗效

目的:观察罗沙司他替代大剂量重组人红细胞生成素(rHuEPO)治疗维持性血液透析(MHD)患者贫血的疗效。方法:收集2019年12月至2020年10月西安交通大学第一附属医院血液净化科MHD患者73例,rHuEPO用量13 805.6±5 243.9 IU/周,评估换用罗沙司他前后血红蛋白(Hb)、铁蛋白、钙、磷、甲状旁腺激素(PTH)、C反应蛋白(CRP)及血压水平。结果:73例患者接受了至少一个月以上的罗沙司他治疗,年龄51.7±14.4岁;透析龄44.9±35.7月;干体重61.3±15.4 kg。基线Hb 83.3±16.7 g/L;罗沙司他口服起始用量112.3±11.7 mg/次,3/周。罗沙司他治疗2周、4周、8周、12周、16周、24周、32周后Hb水平的平均增加3.7±14.1 g/L、8.9±17.9 g/L、14.4±16.4 g/L、18.6±0.3 g/L、21.2±17.1 g/L、28.8±16.1 g/L、30.5±23.7 g/L,与服药前比较均有统计学差异。32周后罗沙司他口服剂量为92.9±15.9 mg/次,3/周,平均Hb 109±10.4 g/L。罗沙司他治疗2~32周后铁蛋白、血钙、PTH、收缩压、舒张压与治疗前没有统计学差异。结论:使用高rHuEPO治疗肾性贫血的Hb仍不达标的MHD患者换用罗沙司他治疗后可升高Hb,且未升高血压。

益生菌改善尿毒症大鼠肠道巨噬细胞介导的细菌移位

目的:评估尿毒症大鼠是否存在肠道屏障功能异常及细菌移位,以及益生菌对肠道屏障功能和巨噬细胞功能的保护作用。方法:5/6肾切除造模尿毒症大鼠,随机分为尿毒症组和尿毒症+益生菌组(乳酸杆菌灌胃4周),处死前2h绿色荧光蛋白标记的示踪大肠杆菌灌胃。比较示踪菌移位情况、肠道黏膜屏障功能、肠道通透性、血中内毒素和炎症因子水平。透射电子显微镜观察肠巨噬细胞形态;检测肠组织中早期生长因子1(EGR1)以及Toll样受体4(TLR4) mRNA和蛋白的表达。结果:尿毒症组肠道组织、肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏中可见绿色荧光标记的示踪菌并且示踪菌与巨噬细胞共定位。服用益生菌后,示踪菌在肠道和肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏中的数量较服用前减少;肠道黏膜上皮细胞排列整齐、微绒毛结构完整、紧密连接结构模糊程度减轻;肠道通透性下降(P<0.05);血中内毒素、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(均P<0.05)水平显著降低;肠巨噬细胞伪足和突触增多;EGR1及TLR4 mRNA和蛋白的表达较前明显减少。结论:尿毒症状态下,肠道细菌发生移位,巨噬细胞起到载体的作用,存在巨噬细胞吞噬功能障碍;乳酸杆菌改善细菌移位和微炎症状态。

鸭、鹅卵黄免疫球蛋白提取的比较研究

以氯仿抽提法提纯鸭、鹅卵黄免疫球蛋白,免疫电泳分析纯度,SDS-PAGE分析成分和含量并将二者进行比较,以琼脂扩散测定二者间及其与鸡IgY、猪IgG、牛IgG、鼠IgG间抗原性交叉情况。结果表明:鸭、鹅卵黄免疫球蛋白均由IgY和IgY(△Fc)组成,二者IgY和IgY(△Fc)的含量比分别为3∶1和12∶1;鸭、鹅卵黄免疫球蛋白间较二者与鸡IgY间抗原性交叉低。

尿毒症大鼠肠道巨噬细胞向促炎型分化加重微炎症状态研究

目的探讨尿毒症大鼠肠道巨噬细胞功能及其与尿毒症微炎症状态的关系。方法SD 大鼠随机分为:5/6 肾切除手术建立的尿毒症组和假手术组。检测血中内毒素、C 反应蛋白(C reactiveprotein,CRP)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。透射电子显微镜观察肠巨噬细胞形态;检测肠组织切片中巨噬细胞活化指标CD11a 和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达;realtime-PCR、Western Blot 法检测巨噬细胞表面的早期生长因子1(early growth response gene 1,EGR1)及Toll 样受体4(Toll-likereceptor 4,TLR4)mRNA 和蛋白的表达;检测肠组织切片中细胞间粘附分子1(intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)、TGF-β的表达。结果尿毒症组与假手术组相比血中内毒素、IL-6、TNF-α和CRP明显增加水平显著增加(t 值分别为- 5.145,- 3.776,- 3.553,- 10.468;P 值分别为<0.001,0.001,0.002,<0.001)。尿毒症组的巨噬细胞突触和伪足较假手术组少。尿毒症大鼠肠组织内CD11a 和iNOS染色表达多;EGR1 及TLR4mRNA 和蛋白表达多;ICAM-1、转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)在尿毒症组表达多。结论尿毒症状态下肠道巨噬细胞向M1 型活化;巨噬细胞吞噬功能障碍;巨噬细胞炎症级联反应通过脂多糖激活EGR1 及TLR4,引起iNOS、TGF-β表达增多,血中CRP、IL- 6、TNF-α水平增加,加重微炎症状态。

动物疼痛识别与评估研究进展

动物疼痛发生率高,且常被饲养者和兽医忽视,然而由疼痛引发的不良影响广泛存在,不仅会引发动物机体多系统强烈的应激反应,而且严重影响动物生存质量和工作质量,继而影响与动物密切相关的人类日常生活及社会生活。此外,实验动物疼痛还会使科研数据出现偏差,准确性降低。因此,科学有效地管理动物疼痛,对动物自身及人类社会均具有十分重要的现实价值和社会意义。笔者通过文献检索,概述了动物疼痛识别与评估的研究现状,分析了未来发展趋势,为实现动物疼痛最小化、提高动物福利和开展动物疼痛干预研究奠定基础,同时为消除国际贸易动物福利壁垒,使中国更好地履行世界动物卫生组织的权利和义务,乃至为提高人类生活幸福感和人类疼痛医学研究提供支持。

尿毒症大鼠肠道屏障功能紊乱与微炎症的关系

目的:评估尿毒症肠道屏障功能状态,探讨肠道屏障功能紊乱与微炎症状态的关系。方法:SD大鼠随机分成尿毒症组和假手术组,5/6肾切除法建立尿毒症模型,假手术组仅打开肾包膜。构建绿色荧光蛋白标记的示踪菌并饲喂两组大鼠,应用PCR法从肝、脾、肠系膜淋巴结、外周血等肠外组织中扩增绿色荧光蛋白特异性基因片段,以检测是否存在肠道细菌移位至该肠外组织位点;HE染色观察肠道组织病理变化;透射电镜观察超微结构变化;免疫组化法观察肠组织JAM-1、claudin-1和Occludin表达;免疫比浊法检测血高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平、酶联免疫吸附试验检测血中炎症因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果:尿毒症组肠道细菌移位率(70%)显著高于假手术组(10%)(P<0.05)。超微结构显示尿毒症组肠上皮细胞间紧密连接结构不完整,微绒毛走行紊乱,部分断裂、消失。与假手术组相比,尿毒症组血hs-CRP(6.03±1.70 mg/L vs 3.45±1.26mg/L)、IL-6(37.62±3.21 pg/ml vs 19.81±6.55pg/ml)、TNF-α(28.48±10.85pg/ml vs 17.33±5.72pg/ml)均显著升高(P<0.05)。结论:尿毒症大鼠存在肠道屏障功能障碍,肠道细菌可移位进入远隔脏器及血液循环并激活炎症反应,可能是尿毒症发生微炎症状态的机制之一。

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测

利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒(AIV)的 HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达,其产物具有抗原性;且不与 H7、H9 AIV的抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示,表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用,同样具有良好的抗原性。试验结果证明,表达的H5亚型AIV的 HA1蛋白,为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。

牛流行热病毒可视化RT-LAMP检测技术的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、简便、可视化地检测牛流行热病毒的分子生物学方法。【方法】根据牛流行热病毒G蛋白基因的6个保守区域设计2对引物,建立牛流行热病毒可视化逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术,优化RT-LAMP的反应条件,将其与PCR方法进行比较。【结果】当Mg2+浓度为3 mmol·L^(-1)、甜菜碱浓度为0.4 mol·L^(-1)、d NTPs mix浓度为1.2μmol·L^(-1)、内外引物浓度比例为8∶1、反应温度为63℃时,反应梯形条带最明显,在反应40 min后可以观察到明显的梯形条带。建立的RT-LAMP检测方法特异性好,只对牛流行热病毒进行扩增;灵敏度比普通PCR高10倍。【结论】该方法操作简便,特异性强,结果判读方便,可用于牛流行热的快速检测。

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。

兽医领域中数据挖掘的探索

随着人们对兽医学在生命科学研究领域中特殊地位认识的被逐步提高，兽医科学的产、学、研过程中积累了大量的数据，尤其在宠物和食品动物方面。例如，食品动物的追踪朔源系统和宠物信息化管理系统的发展使用，存储大量的管理数据和临床数据。数据挖掘（Data Mining）是通过对众多学科中成熟工具和技术的集成和应用，从已有数据资料中获取有价值的信息。

马红球菌菌落印迹检测方法的建立

为建立快速检测环境中马红球菌(R.equi)的方法,本研究以非致病性R.equi ATCC6939以及致病性R.equi毒力相关脂蛋白A(Vap A)分别免疫家兔,制备了兔抗非致病性R.equi多抗与兔抗致病性R.equi Vap A蛋白多抗,并以其作为检测抗体,通过优化反应条件,建立了R.equi菌落印迹检测方法。结果显示该方法可特异性检测R.equi并可区分致病性与非致病性R.equi;其R.equi检测敏感性高,特异性强,均明显优于R.equi的PCR鉴定法。利用本研究建立的方法对全国部分地区马场土壤样本的初步调查表明R.equi在部分地区马场土壤中普遍存在,然而未检测到致病性R.equi。本实验建立的检测方法可应用于我国马场环境中R.equi的流行病学调查,为我国马病防控平台提供有力的技术支持,并为中国现代育马场的建设提供必要的参考。

益生菌改善尿毒症大鼠肠道氧化应激反应保护肠道屏障功能的研究

目的探讨口服补充益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis Bi-07)是否对尿毒症大鼠肠道屏障功能具有保护作用,并探讨其是否通过改善肠道组织氧化应激而发挥生物学效应。方法将30只SD大鼠随机分成假手术组、尿毒症组、尿毒症+益生菌组,每组10只,假手术组仅打开肾包膜,尿毒症组行5/6肾切除术,尿毒症+益生菌组行5/6肾切除术后每日给予动物双歧杆菌乳亚种Bi-07灌胃,持续4周。麻醉大鼠后取空肠、回肠、结肠肠段。应用扫描电子显微镜结合硝酸镧染色观察肠道上皮紧密连接复合体的超微结构。制备肠组织匀浆,采用硫代巴比妥酸缩合法测定丙二醛含量,采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活力。结果相对于尿毒症组,补充益生菌可恢复肠上皮细胞间紧密连接超微结构,微绒毛整齐、结构完整。对比尿毒症组,尿毒症+益生菌组肠道通透性显著降低(P<0.05),血清炎症因子超敏C反应蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α水平显著降低(P<0.05),肠道超氧化物歧化酶活力显著增加(P<0.05),肠道丙二醛呈降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论益生菌动物双歧杆菌乳亚种Bi-07可改善尿毒症大鼠肠道屏障功能,其作用机制可能为抑制肠道氧化应激反应,从而减轻尿毒症大鼠肠道屏障损伤。

马红球菌VapA蛋白的表达及其间接ELISA检测方法的建立

为建立检测马红球菌(R.equi)抗体的方法,本研究对致病性R.equi的标志性抗原毒力相关脂蛋白A(VapA)进行融合表达,并以纯化的VapA重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立了R.equi血清VapA抗体间接ELISA检测方法。结果表明:该方法仅与马VapA阳性血清发生特异性反应,而与H3N8马流感、马鼻肺炎、马传染性贫血抗血清无交叉反应,具有较强的特异性;并且其批内和批间变异系数均小于15%,具有较好的重复性和稳定性。该检测方法的建立可以应用于我国马群R.equi血清流行病学的调查,为我国马病防控平台提供基础依据和数据支撑。

同型半胱氨酸加重实验性尿毒症大鼠肠道上皮屏障功能损伤

目的探讨肠源性尿毒症毒素同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对腺嘌呤诱导的尿毒症大鼠肠道屏障结构功能的影响。方法SD大鼠分为对照组(NC组,n=10)、Hcy组(H组,n=10)、尿毒症(U组,n=10)、尿毒症+Hcy(UH组,n=10)和尿毒症+Hcy+益生菌(VSL#3,Sigma-Tau公司,美国)(UHV组,n=10)。腺嘌呤灌胃及皮下注射Hcy造模,检测肾功能及病理组织染色评估动物模型。HE染色及透射电镜观察肠道组织结构病理变化。检测血和肠组织Hcy、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平、内毒素和肠道通透性。Western blotting法检测紧密连接(tight junction,TJ)蛋白claudin-1、occludin和ZO-1水平。结果与NC组相比,各组血清和肠组织匀浆中Hcy(血清F=153.666,P<0.001;肠组织F=44.456,P<0.001)、IL-6(血清F=86.845,P<0.001;肠组织F=89.946,P<0.001)、TNF-α(血清F=29.782,肠组织F=23.629,P<0.001)、MDA(血清F=52.367,P<0.001;肠组织F=58.976,P<0.001)、血清内毒素水平(F=37.287,P<0.001)和肠通透性(F=50.539,P<0.001)显著增高,SOD活性降低(血清F=106.538,P<0.001;肠组织F=114.599,P<0.001),以UH组为著;UH组肠道病理损伤最严重,各组TJ蛋白水平不同程度降低。补充益生菌VSL#3可不同程度上改善氧化炎症损伤并上调TJ蛋白表达丰度。结论Hcy通过诱导氧化炎症损伤,加重肠通透性增加和上皮屏障破坏。复合益生菌VSL#3可通过降低Hcy诱导的氧化炎症水平改善此损伤。

绒毛蛋白1在单侧肾切除Habu肾炎小鼠模型中的作用

目的探讨单侧肾切除(UNX)小鼠Habu肾炎模型与正常小鼠Habu肾炎模型在肾脏功能、肾脏病理表现及肾小球蛋白绒毛蛋白1(VIL 1)表达等方面的异同及其分子机制.方法将24只6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠(18~20 g)随机分为2组,实验组(n=12)接受UNX后通过尾静脉注射竹叶青蛇毒(HSV)构建Habu肾炎模型(HSV-U NX组),对照组(n=12)接受假手术后行蛇毒尾静脉注射构建Habu肾炎模型(HSV组);通过血液生化检测2组小鼠肾功能水平,并采用过碘酸-雪夫染色观察2组小鼠肾组织病理改变;进一步通过蛋白质组学对二者肾小球蛋白表达量进行分析,筛选出2组间的表达差异蛋白,于体外小鼠系膜细胞中研究差异蛋白对细胞增殖及凋亡的作用及机制.结果HSV-UNX组小鼠的血肌酐和尿素氮水平较HSV组显著升高(均P<0.01),其肾组织系膜溶解水平高于HSV组(P<0.0001),系膜增殖水平低于HSV组(P<0.001);蛋白组学分析及Western blotting证实VIL1在HSV-UNX组小鼠的表达量低于HSV组;在小鼠系膜细胞中,敲低VIL1表达可通过上调caspase 3、Bax、p21及p27蛋白表达,促进细胞细胞凋亡(P<0.01),抑制细胞增殖(P<0.05).结论VIL1在单肾切除Habu肾炎小鼠模型中表达下调,VIL1下调可通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡导致肾小球自我修复能力下降,加重肾功能损害.

肠道M细胞形态结构

1974年，Owen在肠黏膜滤泡相关上皮（Follicle—associated epithelium，FAE）中发现了一种微皱褶细胞——M细胞。M细胞能特异性结合肠道大分子物质及微生物并将起摄取、转运至位于其下的APC进行识别、处理并激活T、B淋巴细胞，继而开启肠道黏膜免疫应答作用。对肠道M细胞形态结构的研究不仅有助于人们进一步了解肠黏膜免疫机理，而且对于口服疫苗的研制有着重要的实践意义。