猪繁殖与呼吸综合征病毒2型TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为了准确、特异、高效地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(PRRSV2),本研究根据GenBank上登录的PRRSV2不同谱系流行毒株的ORF6基因序列,选取保守区域设计合成了1对特异性检测引物和1条MGB探针,经优化退火温度、引物和探针比例等反应条件及敏感性、特异性、重复性试验,建立了检测PRRSV2的TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果:以猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(PRRSV1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪细小病毒(PPV)等阳性核酸为模板,均无扩增;对标准质粒的最低检测下限为1×10^(1)copies/μL,建立的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.994;稳定性和重复性好,批内和批间变异系数均小于1.78%。应用该方法对保留的30份临床阳性样品进行检测,结果阳性100%,Ct值在22~36间。综上,本研究建立的TaqMan MGB荧光定量PCR方法可用于临床和实验室中PRRSV2的快速检测,为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供了技术支持。

猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。

猪轮状病毒DN30209株VP4全长蛋白表达及多抗制备和鉴定

为开展猪轮状病毒(PRV)及其VP4蛋白相关特性研究,参照Gen Bank所收录的猪轮状病毒JL94、OSU等株序列设计一对特异性引物,从实验室分离鉴定的猪轮状病毒DN30209株扩增约2 330 bp VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-p MD18-T。重组质粒经测序、序列比对及分析。结果表明,DN30209株VP4全基因长2331 bp,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4基因连接到p GEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒VP4-p GEX-6P-1。阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112 ku,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价到1:105,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测表明该多抗均可与PRV具有很好的抗原抗体反应性,为猪轮状病毒研究提供有效实验材料。

舒泰复合赛拉嗪和强痛灵对猫呼吸功能的影响

猫是世界上最受喜爱的宠物之一，也是研究中枢神经系统功能、用药后呼吸系统及心血管系统的功能效应、生物反射等理想动物模型。东北农业大学兽医外科教研室结合国内外猫的麻醉现状及猫的独特的科研价值和在人们生活中所占有的独特的地位，开发出适合于猫的复方麻醉剂，

2019—2021年江苏地区PCV3感染情况调查及其Cap基因的遗传演化分析

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在江苏地区规模化猪场的感染及病毒演化情况,对2019—2021年收集的113份临床组织样品进行Cap基因的检测,应用DNAStar和MEGA软件对获得的序列进行遗传演化分析。结果显示:PCV3样品阳性率为37.17%(42/113),猪场阳性率为73.91%(17/23)。对29个阳性样品的PCR产物直接测序,显示核苷酸序列高度同源,同源性为97.3%~100.0%。挑取其中的12个阳性样品,扩增Cap全长序列,连接至pMD19-T平末端载体后测序,显示12条序列的核苷酸同源性为97.5%~99.8%,与国内外其他PCV3毒株Cap基因的同源性为97.0%~100%。遗传演化分析显示,3条序列与国内外PCV3亚群3a的毒株处于一个大的分支,6条序列属于3b,3条序列形成独立的分支(3c)。推导编码氨基酸后对24和27位氨基酸位点进行分析,1条序列为A^(24)K^(27),2条序列为A^(24)R^(27),9条序列为V^(24)K^(27)。本试验丰富了江苏地区PCV3感染的分子流行病学数据,为该地区PCV3感染的综合防控提供了科学依据。

产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备

为了制备产气荚膜梭菌致病性毒力因子α毒素的单克隆抗体,试验采用PCR法获得α毒素基因,克隆入原核表达质粒p ET-30b,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,构建表达α毒素的重组菌BL21/p ET-30b-α;IPTG诱导重组菌表达,并进行SDS-PAGE分析,以纯化的重组α毒素蛋白为免疫原免疫Balb/c小鼠,经筛选、亚类鉴定及特异性试验检测单克隆抗体。结果表明:重组菌表达的α毒素蛋白分子质量约为43 ku;杂交瘤细胞株3C5能够稳定分泌抗α毒素单克隆抗体,单克隆抗体亚型为Ig G2a型,能够特异识别产气荚膜梭菌天然α毒素蛋白。说明制备的单克隆抗体具有良好的反应原性。

ST细胞表达TGEV主要蛋白的研究

为了提高猪睾丸(swine testicular,ST)细胞的转染效率,研究猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)各蛋白的功能,试验利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的真核表达载体pEGFP-C1转染ST细胞,对ST细胞的转染条件进行优化;然后利用优化后的转染条件将TGEV各蛋白真核表达质粒转染到ST细胞,通过免疫印迹(Western-blot)和间接免疫荧光(IFA)方法检测TGEV各蛋白在ST细胞中的表达情况。结果表明:悬浮细胞转染法(在细胞传代的同时进行转染)比贴壁细胞转染法(待细胞贴壁后再进行转染)的转染效率更高,且转染质粒与转染试剂的比例为1∶3时是转染ST细胞的最佳比例。利用优化后的转染条件将TGEV各蛋白真核表达质粒转染到ST细胞,48 h后采用IFA法检测发现TGEV各蛋白在ST细胞中成功表达,Western-blot法检测发现TGEV各蛋白在ST细胞中表达的大小与预期相符。说明优化后的转染条件可用于提高ST细胞的转染效率。

MFM对猫呼吸功能的影响

猫是世界上最受喜爱的宠物之一,也是研究中枢神经系统功能、用药后呼吸系统及心血管系统的功能效应、生物反射等理想动物模型[1-3]。东北农业大学兽医外科教研室结合国内外猫的麻醉现状及猫的独特的科研价值和在人们生活中所占有的独特的地位,开发出适合于猫的复方麻醉剂(MFM,由舒泰、赛拉嗪、强痛灵等组成)[4-5],并对其麻醉后呼吸频率(RR)、血氧饱和度(SPO2)、呼末二氧化碳分压(PetCO2)、每分钟通气量(MV)和潮气量(TV)等指标进行监测,以评价该制剂对猫呼吸功能的影响。

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。