一株产耐热普鲁兰酶菌株Anoxybacillus sp. LM14-2分离鉴定及酶学性质研究

从云南轮马热泉下游淤泥中筛选得到了一株产耐热普鲁兰酶菌株LM14-2。根据形态特征及16S rRNA序列同源性分析,初步判定为Anoxybacillus sp.LM14-2。该菌株发酵上清液中有耐热普鲁兰酶积累,其反应最适pH值为6.0,最适温度为70℃。利用染色体步移技术获得了完整的普鲁兰酶编码基因(HQ660582),经序列相似性进一步分析,确定该蛋白与I型普鲁兰酶保守区b相吻合。通常的普鲁兰酶在高温下很快失活,难以满足淀粉加工,洗涤剂等相关工业的需求,而该新型的耐热普鲁兰酶的作用温度广泛,热稳定性较好,65℃保温55 h后达到其半衰期,具有广阔的开发应用前景。

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。

银耳多糖的急性毒性、遗传毒性和亚慢性毒性研究

目的研究银耳多糖的急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性,为银耳多糖开发利用提供科学数据。方法依据食品安全国家标准,对银耳多糖进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验和90 d经口毒性试验。结果小鼠急性经口LD50>12.0 g/(kg·bw),属实际无毒级;三项遗传毒性试验结果均为阴性;大鼠90 d经口毒性实验中,各剂量组动物生长发育良好,体重、增重、进食量、食物利用率、血液学、血生化、尿常规、脏器湿重及脏/体比等指标与阴性对照组比较均无显著性差异(P>0.05),组织病理学观察未见与试验因素有关的变化,确定该银耳多糖最大未观察到有害作用剂量(NOAEL)为:雄性动物为7.21 g/(kg·bw),雌性动物为8.18 g/(kg·bw)。结论在本次条件下,银耳多糖未见急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性。

银耳多糖对SD大鼠的致畸作用

目的探讨银耳多糖(TFP)对SD大鼠是否存在致畸作用,为TFP的安全评价和开发利用提供实验依据。方法制备TFP,按2.5%、5.0%、10.0%(质量分数)掺入基础饲料,确定实际染毒剂量2.03、4.06、8.43 g/kg三个水平。选择成熟SD大鼠300只,其中雄性100只、雌性200只,受孕后将孕鼠分为阴性对照组、15 mg/kg环磷酰胺(CP)阳性对照组、2.03 g/kg TFP组、4.06 g/kg TFP组、8.43 g/kg TFP组,阴性对照组于孕第6~15 d分别给予基础饲料,各剂量组于孕第6~15 d给予相应饲料,CP组于孕第12 d腹腔注射1次15 mg/kg CP。观察孕鼠生长状况,测量受孕第0、6、9、12、15、20 d的体重、增重、子宫连胎重和净增重。于孕第20 d处死孕鼠,剖腹检查母体受孕情况,记录黄体、着床、吸收胎、活胎、死胎数目等。观察胎仔外观、骨骼、内脏畸形情况,计算畸形率。结果TFP各剂量组的孕鼠行为正常,体重稳步增长,未观察到异常表现和流产情况。与阴性对照组比较,TFP各剂量组孕鼠的体重增重等一般指标差异均无统计学意义(P均>0.05);卵巢黄体数、胎仔的着床数和吸收胎、死胎、活胎分布差异均无统计学意义(P均>0.05);胎仔的一般发育情况、各单项的畸胎率、总畸胎率和畸形窝百分率的差异均无统计学意义(P均>0.05)。TFP的未观察到有害作用剂量(NOAEL)为8.43 g/(kg·bw)。结论根据《食品安全国家标准致畸试验》判定,本次研究未观察到TFP对孕鼠的母体毒性、胚胎发育毒性和致畸性。