基于全细胞催化合成NADP重组细胞复合通透剂的筛选

本文以重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3) p ET30α(+)-Nmnat为研究对象,考察化学通透剂处理重组菌对其催化合成NADP的影响。实验显示,在单因素筛选实验中,四种通透剂曲拉通X-100、吐温80、二甲基亚砜和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对细胞进行通透化处理均可提高全细胞催化产率,且提高幅度差距并不显著。进一步采用析因设计考察四种通透剂的复合效应,除了曲拉通X-100与吐温80和曲拉通X-100与CTAB交互作用的P大于0. 05为不显著,其余所有交互作用项P值均小于0. 05,呈现显著性,且复合通透剂中,仅单一增加CTAB量,复合体系的协同作用将减少,制约作用增加,不适宜用于复合配方。最后采用中心组合设计进一步对复配效果进行优化,通过拟合得到最佳通透剂配比为曲拉通X-100(1. 64%),吐温80(2. 53%)以及二甲基亚砜(1. 06%),此时NADP预测产率达到77. 46%,与实际验证产率均值77. 05%相差甚微,说明实验优化模型具有良好预测性,优化结果与未添加通透剂相比提升近47%,表明优化复合通透剂配方更有利于提高重组菌催化合成NADP。

磁性纳米颗粒固定化乙醇脱氢酶的研究

本研究采用3-丙氨基三乙氧基硅烷(APTES)和戊二醛修饰包裹有SiO2磁性Fe3O4纳米颗粒表面,将其作为固定化载体固定化乙醇脱氢酶,研究固定化条件对固定化效率的影响,并对固定化酶性质进行分析。研究发现,当Fe3O4@SiO2纳米颗粒修饰上氨基和醛基后依然具有良好的水分散性和胶体稳定性,适合作为固定化载体。通过单因素优化,发现当最适给酶量为11. 3U/100 mg,搅拌转速为150 r/min,固定化p H和固定化温度分别控制在6. 5和5℃～15℃,固定化时长为45 min时,具有较好的固定化效果,固定化率可达到60. 2%。在此条件下制备得到的固定化酶与游离酶相比,固定化酶具有良好的耐高温和耐碱性。所得固定化乙醇脱氢酶在连续使用8次后,固定化率仍保留在57%左右,表明该固定化酶具有较好的操作稳定性,可为连续生产NADH提供技术依据。

NMN转移酶和乙醇脱氢酶共固定化及其动力学特性

采用磁性纳米颗粒对烟酰胺单核苷酸(NMN)转移酶和乙醇脱氢酶进行共价共固定,用以生产NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸),并对共固定化条件、共固定化双酶酶学性质及其动力学进行了考察。结果显示:双酶最佳共固定化反应条件为:NMN转移酶和乙醇脱氢酶添加量分别为6.5U/mg和10.3U/mg,体系pH控制在5.0~7.0,25℃固定化2 h,NADH产率可达到87%,与游离酶的催化产率73%相比提高了14%。所得共固定化双酶在连续使用11次后,剩余酶活仍保留在61.1%左右,表明共固定化酶具有较好的操作稳定性。双酶动力学方程推导与验证结果表明:共固定化双酶反应体系符合米氏方程,其动力学反应速率取决于固定化乙醇脱氢酶的反应速率。