miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

应用分子生物学技术鉴定体液斑迹组织来源的研究进展

对现场生物物证进行鉴定,获取最多信息是法医物证工作者的责任和义务。过去,以DNA为基础的STR个体识别以及DNA来源人特征刻画技术都已经完全或正在逐渐被法庭科学接受和认可。而对生物物证进行组织属性鉴定也正愈益显示其重要价值,因为这有助于案件现场重建和案情回溯。本文对用分子生物学手段解决组织属性鉴定的理论基础、研究进展以及未来研究的可能方向进行综述,以期为相关研究人员提供参考意见。

DNA来源人特征刻画的法庭科学应用研究

DNA是遗传和繁殖的基础,控制着人高矮、肤色、发质、骨骼、神经等方面的差异以及器官的生长、发育和衰老等,具有唯一性、同一性和遗传性等特点,对个体识别和亲缘鉴定起着决定性作用。当前法医DNA检验主要依靠STR复合扩增技术,但STR主要分布在基因组的非编码区,难以提供更多与人表型特征相关的信息,所以其发挥作用的方式主要是"比对";而对于既无目标嫌疑人又无其它线索的案件,很难利用现场检材中蕴含的生物学信息去主动"查找"嫌疑人及指导案情分析。近年来,DNA特征刻画技术成为法医DNA领域重要的研究内容和热点,其目的是通过对检材DNA的深度挖掘,推断检材供者的生理、病理和表型信息,刻画DNA来源人的种族地域、外貌、疾病等特征,从而缩小犯罪嫌疑人的查找范围,为侦查提供线索。本文对DNA来源人特征刻画领域的研究进展和发展趋势进行综述,希冀对相关研究和实践提供参考和借鉴。

遗传病推断复合扩增体系的构建

目的通过对人类DNA进行突变基因检测推断该DNA供者是否患特定遗传病,建立对DNA样本突变检测的方法,运用于法庭科学的DNA来源人特征刻画领域,为案件侦查提供线索。方法根据遗传性耳聋、β-地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症三类遗传疾病各突变位点在中国人群中的出现概率,挑选了20个位点,设计引物,利用等位基因特异性PCR和毛细管电泳技术构建推断这三类遗传疾病的PCR检测体系。结果构建了包含20个突变位点,能够同时检测遗传性耳聋、地中海贫血、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)三类遗传疾病的毛细管电泳复合扩增实验体系。结论在法医学实验室开展检材DNA来源人的疾病特征推断是可行的。通过进一步研究发展,该技术有望在刑事案件侦查中发挥作用。

一种复合miRNAs检测体系的构建及在体液组织属性来源鉴定中的应用研究

目的选取5种常见体液的10条特异性miRNAs基因,通过逆转录-终点法PCR技术构建复合扩增体系,并对体系的灵敏度进行测试,之后使用该体系检测静脉血、精液、月经血、唾液和阴道分泌液中miRNAs的表达情况。方法首先设计10条miRNAs标记的逆转录引物和cDNA扩增引物,构建10个标准miRNAs标记的荧光复合体系,并进行灵敏度测试。然后使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取体液样本的RNA,运用荧光复合体系进行检测,并对检测结果进行分析。结果本研究得到10个标准miRNAs标记的分型结果,标准miRNAs标记的荧光复合体系的检测灵敏度为总miRNAs模板量≥1ng。静脉血样本10条miRNA检测结果:miR-451、miR-144-3p、miR-144-5p,峰值在3000~7000 rfu之间;月经血样本分型结果:miR-214、miR-451、miR-144-3p、miR-205-5p、miR-203-3p,峰值在800~7000 rfu之间;阴道分泌物样本分型结果:miR-144-3p、miR-203-3p,miR-205-5p,峰值在600~3000 rfu之间。唾液样本分型结果:miR-451、miR-144-3p、miR-205-5p、miR-203-3p,峰值在600~7000 rfu之间;精液样本分型结果:miR-888、miR-144-3p、miR-891a,峰值在1000~7000 rfu之间。结论本研究建立的该体系能够对5种法医学常见体液(静脉血、唾液、精液、月经血和阴道分泌物)进行区分鉴定,为犯罪现场体液斑痕鉴定提供了新的检测方法。

残留基因组对miRNA检测的影响评估

目的研究判断常规试剂盒所提RNA中残留的基因组是否会对后续RNA检测产生影响并建立相应的纯化应对策略。方法使用miRNeasy?Mini Kit提取外周血和月经血样本中的RNA,用TURBO DNA-free?Kit对部分RNA纯化,通过紫外荧光定量、琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量检测等方法对比纯化前后是否存在显著差异性,并使用琼脂糖凝胶电泳以及毛细管电泳DNA分型扩增来判断外周血样本中提取的RNA是否有基因组残留。结果使用试剂盒进行DNA纯化后可有效去除残留的基因组DNA。纯化后的RNA浓度较纯化前大都有所下降;琼脂糖电泳结果显示纯化后无DNA条带,RNA条带纯化前后差异不大,完整性良好;RNA实时荧光定量检测结果显示单个microRNA(miRNA)在纯化前后有些会存在总量上的差异,但6种miRNA在外周血和月经血中相对表达量高低始终保持一致。结论常规RNA提取试剂盒所提RNA中含有的DNA会影响部分miRNA检测结果,但不会影响对体液组织属性来源的判定。对提取的RNA进一步纯化可有效去除基因组DNA残留,但同时会影响RNA总量。要根据实际研究需要,决定是否应该予以纯化。

27-plex SNP种族推断方法的优化及验证

人类学中常将人群分为东亚黄种人、欧洲白种人和非洲黑种人。27-plex SNP种族推断体系可针对来自东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群的样本进行分型检测进而推断其祖先来源。本研究对该体系获取样本分型后的种族推断分析方法进行了进一步优化,建立了一种基于似然比、祖先成分和种族归类的推断分析方法,并对4个来自东亚、欧洲、非洲及其混合人群的测试样本进行种族来源推断。使用基础参考数据库交叉验证和1010份测试样本验证两种方式进行了种族推断方法流程的评估研究。验证结果表明该方法体系在东亚、欧洲、非洲及欧亚混合人群中的推断准确性均高于99%。本种族推断方法可对DNA来源人的种族信息进行刻画,在人类分子遗传学、法医遗传学等领域有重要的应用价值。

云南傣族与广西侗族18个STR基因座的遗传多态性

目的调查云南傣族和广西侗族无关个体18个STR基因座(D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、v WA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、D12S391、TPOX、TH01、Penta E和D6S1043)的遗传多态性并研究其法医学应用价值。方法采用DNA TyperTM19试剂盒对100名云南傣族和70名广西侗族的无关个体血样进行复合扩增,用遗传分析仪3130XL对扩增产物检测,用Gene Mapper ID v3.2软件进行基因分型,并计算群体遗传学参数。结果在100名云南傣族和70名广西侗族的无关个体中,云南傣族共发现185种等位基因,广西侗族共发现162种等位基因。傣族单个等位基因频率分布在0.005-0.600、侗族在0.007-0.493;傣族与侗族累计个人识别能力均大于99.999 999 999 999 999 999 99%。结论这18个STR基因座在云南傣族和广西侗族地区具有高度多态性,可满足对这两个群体的个体识别和亲权鉴定。

DNA来源人种族推断研究进展

随着跨地域跨国犯罪明显增加,通过对生物检材DNA深度遗传信息挖掘进行来源人特征刻画已成为研究热点,其中种族推断是非常重要的研究方向。用于种族推断常用的遗传标记称为祖先信息位点(AIMs),它是指在不同人群之间频率差异非常大的多态性基因位点,包括单核苷酸多态性(SNPs)、插入缺失(In Dels)多态性等位点,其中SNPs成为筛选AIMs位点、分析人群遗传结构的重要遗传标记。本文重点对DNA来源人种族推断领域的研究现状、研究方法等进行论述,希冀对相关研究和实践提供参考和借鉴。

广西瑶族和苗族人群18个STR基因座遗传多态性

采用PCR扩增及毛细管电泳技术对广西瑶族、苗族人群138名个体进行18个短串联重复序列位点分析。在广西瑶族样本中检出167种等位基因,在广西苗族样本中检出159种等位基因,广西瑶族基因频率分布为0.007~0.579,广西苗族为0.007~0.537,所有基因座基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）。广西瑶族、苗族群体杂合度分别为0.571~0.943和0.603~0.956,个人识别能力为0.767~0.971和0.782~0.968,多态信息总量为0.520~0.890和0.580~0.870;非父排除率分别在0.258~0.884和0.294~0.910,累积个体识别力为0.999 999999 999 999 999 976 02和0.999 999 999 999 999 999 973 38;累积非父排除概率为0.999 999 978 8和0.999 999992 1。

广西壮族人群18个STR基因座多态性

目的调查广西壮族人群18个短串联重复序列(Short Tandem Repeat,STR)位点的遗传多态性,并研究其法医学应用价值。方法采用DNA Typer^(TM) 19荧光标记复合扩增试剂盒,对广西壮族223名无关个体血样进行复合扩增,使用3130XL遗传分析仪进行检测,Genemapper ID v3.2软件进行分析。结果共检出196个等位基因,基因频率分布在0.002~0.516之间,杂合度在0.614~0.888之间,个体识别能力在0.788~0.978之间,多态信息含量在0.56~0.88之间,非父排除概率在0.308~0.771之间。结论 18个STR位点在广西壮族人群中具有良好的遗传多态性,可用于群体遗传学及法医学研究。

广西汉族与苗族人群30个InDels的遗传学调查

目的 采用Investigator？DIPplex试剂盒调查广西汉族、苗族中的群体遗传学数据,并评估其法医学应用价值。方法 对广西汉族、苗族的100名无关个体的30个In Dels位点进行复合扩增,统计分析各位点的频率数据、群体遗传学参数。结果 经Bonferroni校正,30个In Dels位点的分布均符合Hardy-Weinberg平衡;各位点在广西汉族、苗族人群中的累积个体识别率分别为0.999 999 999 98、0.999 999 999 97,累积非父排除率均大于0.96。30个In Dels在广西汉族中6个位点（D111、D118、D99、D114、D64、D39）He〈0.3,苗族中8个位点（D111、D118、D99、D122、D64、D81、D39、D84）He〈0.3。通过Genepop 4.2软件计算Fst值,除D84（0.080 7）外,其余位点均小于0.06。结论 该组30个In Dels位点在广西汉族、苗族人群中具有较高的多态性,可以作为现有STR检验体系的补充。

27重SNP种族推断体系在案件中的应用

应用公安部物证鉴定中心研发的27重SNP种族推断体系,对一起爆炸案件现场的检材进行种族来源推断,成功获得了该现场检材DNA的种族信息,其属混合人种,具有82%欧洲成分和11%东亚成分。该案循此侦查,查找到了嫌疑人的重要线索。本案所用推断体系可在常规DNA实验室应用,无需特殊仪器设备,可操作性强,所需DNA量小,适用于大部分检材。针对有些案件现场生物检材STR分型未能比中嫌疑人,使用该体系进行种族推断,可进一步挖掘现场检材蕴含的遗传信息,刻画嫌疑人,缩小侦查排查范围,为案件定性提供依据。

基于microRNA表达量及判别分析的外周血与月经血鉴别

目的根据2种血液类体液(外周血和月经血)和3种非血液类体液(唾液、精液、阴道分泌液)中多种微RNA(microRNA,miRNA)差异表达的特征构建判别分析模型,形成外周血与月经血的鉴别方案。方法从文献中筛选出6种miRNA(miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p),收集5种法医学常见体液样本(外周血、月经血、唾液、精液和阴道分泌液),并将样本划分为训练集及测试集,采用SYBR Green荧光实时定量PCR技术检测,基于训练集的表达量数据构建判别分析模型,另外采用测试集的表达量数据检验该模型的准确度。结果成功构建了可同时区分血液与非血液类样本以及区分外周血与月经血样本的判别分析统计模型,模型的鉴别准确率达99%以上。结论本研究为外周血和月经血样本的法医学体液鉴别提供了科学准确的鉴别策略,有望在法医学实践中应用。

不同RNA提取方法的效能比较

目的比较7种不同的RNA提取方法(6种商业化试剂盒加Trizol有机提取法)的相对提取效率,为法医实践中选择提取高质量的RNA/miRNA提供参考。方法分别使用6种不同的商业化试剂盒以及Trizol有机提取法提取晾干的外周血棉签样本,通过对RNA进行紫外荧光定量检测、琼脂糖凝胶电泳检测和测定样本中内参基因RNU6b的相对含量等方式进行评价。结果各试剂盒所提RNA/miRNA的质量评估和表达分析结果有明显差异,其中Trizol有机提取法和试剂盒RNeasy?Mini可以得到更高质量和纯度的RNA/miRNA, 170μL外周血中所提取的RNA总量可达到(3860.50±182.12)ng、纯度(OD260/280)约为1.84±0.03,且琼脂糖电泳结果显示RNA完整性好,在后续实验中表现良好。结论在所有的提取方法中,综合考虑RNA的数量、质量以及Realtime PCR检测结果,更适合提取外周血RNA的方法为RNeasy?Mini Kit和Trizol有机提取法。

27重SNP系统推断种族来源的效能

目的验证和评估27-plex SNPs复合扩增系统(简称27重SNP系统)推断种族来源的效能。方法验证27重SNP系统的灵敏度和种属特异性;用该系统检测非洲、华南地区汉族、回族、苗族、彝族、藏族、维吾尔族、欧洲、中亚、西亚、南亚、东南亚、南美洲等13个人群的533份样本,将其分型数据与Hap Map数据库的东亚(CHB)、欧洲(CEU)、非洲(YRI)3个代表人群的分型数据进行聚类分析,分析祖先成分,计算匹配概率;分析46份盲测样本的种族来源。结果该系统灵敏度达0.125 ng;除猩猩和猴子分别检出20和6个位点,其余动物样本仅在rs10496971位点检出扩增产物;该系统可以进行洲际人群区分,但是无法区分东南亚与东亚人群,无法细分广东汉族与彝族、回族、苗族和藏族等少数民族人群;盲测样本洲际人群推断的准确率为100%。结论27重SNP系统灵敏度高、特异性好,可准确区分个体的非洲、欧洲或东亚祖先成分。该系统不具备亚人群区分效力,有待后续筛选更多的特异性祖先信息标记,以满足区分东南亚人群以及中国不同族群的需要。

mRNA分析在体液斑迹组织来源推断中的应用研究进展

mRNA因其自身的不稳定性和易被降解的特性而一直被法医学研究所忽略。然而,终点逆转录PCR、实时荧光定量PCR、转录组分析等分子生物学技术的进步打破了这些关于mRNA的传统认知,为mRNA分析的法医学应用奠定了基础。目前,基于mRNA分析的体液斑迹组织来源的推断已有主流方法,就是构建复合检测体系检测不同体液中特异性mRNA分子的表达。2011年至今,欧洲DNA分型工作组(EDNAP)组织了6次联合试验,评估了mRNA分析在体液鉴定中的有效性和可重复性。本文主要概述mRNA分析技术在体液斑迹组织来源推断中的研究进展及应用。

基于超高效液相色谱–质谱联用技术鉴别血迹组织来源

犯罪现场血液斑迹的成分蕴含许多与案件相关的重要信息,通过血迹成分检测,推断血迹组织来源,有助于案件性质的分析研判和法庭诉讼的技术支撑。基于不同体液的生理功能和体内代谢的显著差异,不同组织来源的血液中差异稳定的内源性小分子可作为鉴别血迹组织来源的重要依据。本文应用超高效液相色谱–质谱联用技术(UHPLC-MS),以小分子化合物为分析对象,通过对外周血、月经血实验样品的前处理、液相分离富集及高分辨质谱检测,综合多种数据分析手段,筛选出区分外周血与月经血的特征小分子,并结合人类代谢组学数据库(HMDB)进行结构及性能检索,确定外周血7个特征小分子和月经血4个特征小分子。将建立的基于UHPLC-MS的血迹组织来源鉴别方法应用于10份血迹样品的测试,鉴别结果准确。本文建立的方法可为实际案件中血迹组织来源鉴别提供新的技术手段。

分子标志物microRNA在法医学中的研究进展

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度为18~24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,其表达具有高保守性、时序性和组织特异性。miRNA不易被RNA酶降解,对温度、酸碱度等环境因素的变化有较强的抵抗性,在腐败组织中也能检测出来。因此,miRNA在法医学体液来源鉴定、死亡原因推断等方面具有广阔的应用前景。本文就miRNA作为在体液鉴定、死亡时间推断以及死亡原因分析等法医学实践中的应用进行简要综述。

miRNA鉴别体液研究中内参基因的选择与应用

准确鉴定案发现场体液斑迹的组织属性来源可为案件侦查提供有力证据,故具有重要的研究价值。miRNA因其稳定性、体液特异性和检测灵敏快捷,成为法医物证体液鉴定的研究热点。实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性好,可称作法医学定量检测miRNA的金标准。然而对于相对定量,欲获得准确、可靠的结果,选用恰当的内参基因是关键的前提保证。因此,本文主要对miRNA体液鉴定所用内参基因的研究进展、选择方法及应用挑战等作简要综述,以期为相关研究提供参考。