兔出血症病毒镇江株的分离鉴定及VP60蛋白活性表达

试验旨在分离兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)镇江株,分析其遗传进化变异,并表达具有良好活性的重组VP60蛋白。通过排除细菌感染、血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测、动物攻毒试验与病毒传代、LD50测定等方法,自江苏省镇江市某兔场发病死亡动物肝脏组织样品中分离病原并鉴定;RT-PCR方法获得VP60基因,通过分析VP60基因核苷酸及氨基酸序列研究其遗传进化;将VP60基因与pCold-Sumo载体连接,构建低温诱导、融合Sumo标签原核表达载体,15℃、IPTG诱导表达重组VP60蛋白并对表达产物进行反应原性鉴定。结果显示,分离鉴定获得RHDV ZJ2015毒株,该毒株能凝集人"O"型红血球,HA效价为11log2,其血凝性能被RHDV(AV33)抗血清抑制,该毒株的LD50为10-6.38/mL,具有较强的毒力;RT-PCR扩增得到大小约为1 740bp的特异性条带,系统进化树分析显示,该毒株属于RHDV1抗原遗传变异株(RHDVa),与RHDV1和RHDV2VP60基因核苷酸序列同源性分别为89.4%～97.6%和81.1%～81.5%,氨基酸序列同源性分别为93.8%～98.3%和87.4%～87.6%。构建的低温原核融合表达质粒pCold-VP60在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,通过SDS-PAGE及Western blotting分析,在分子质量74ku处有特异性表达蛋白条带,且与抗血清发生特异性抗原抗体结合反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。本研究为开展兔病毒性出血症流行病学研究、开发新型重组疫苗与诊断试剂提供参考依据。

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID_(50))的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID_(50)绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID_(50)、鸡胚半数感染量(EID_(50))与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^(6.375) EID_(50),细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID_(50)值为10^(7.0)/0.1 mL,EID_(50)为10^(7.5)/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。

自噬对布鲁氏菌在巨噬细胞内增殖情况的影响

为探究自噬作用对布鲁氏菌(Brucella)在巨噬细胞(Mφ)内增殖活力的影响,本研究将体外培养的Mφ细胞分组,分别采用自噬激活剂雷帕霉素(Ra)或抑制剂3-MA处理细胞,并在不同处理的细胞组中接种表达绿色荧光的重组猪种布鲁氏菌(rB.suis-GFP),在接种后0.5 h^24 h,一方面通过细胞中LC3-Ⅱ含量及Mφ内B.suis数量的测定,另一方面通过激光共聚焦显微镜观察LC3-Ⅱ与B.suis共定位情况。结果显示,感染B.suis后0.5 h,Mφ即可发生自噬作用,并且Ra+Mφ+B.suis组LC3-Ⅱ含量显著高于其它组,表明B.suis的感染能够促进Mφ内LC3-Ⅱ的形成,增强Mφ的自噬作用;另一方面,Ra+Mφ+B.suis组胞内B.suis数量显著高于3-MA+Mφ+B.suis组与Mφ+B.suis组,表明自噬作用能够促进B.suis在Mφ内的增殖;但随着胞内B.suis数量的增加,各组LC3-Ⅱ的水平却逐渐下降,表明B.suis感染Mφ数量达饱和后,Mφ虽然启动自噬作用杀灭了部分B.suis,但却不能完全抑制B.suis在Mφ内大量增殖。本研究为初步确定自噬在B.suis增殖过程中的作用提供了依据。

猪布鲁菌感染对巨噬细胞泛素蛋白酶体功能的影响

巨噬细胞（macrophage，Mφ）是布鲁菌的主要宿主细胞，为了探明布鲁菌感染与Mφ泛素-蛋白酶体功能之间的关系，本试验在应用蛋白酶体抑制剂Lactacystin与促进剂IFN-γ的基础上，对Mφ感染猪种布鲁菌S2株（Brucella suis，B．suis）后细胞上清中泛素、蛋白酶体及胞内B．suis数量进行了检测。结果显示，IFN-γ与Lactacystin对Mφ泛素的表达均有明显的促进作用，且IFN-γ效果显著优于Lactacystin；其次IFN-γ有效促进了M,p蛋白酶体的表达，而Lactacystin显著抑制了Mφ蛋白酶体的表达。在此基础上，将B．suis感染不同状态的MQ，在0．5～24h分别进行胞内B．suis计数，研究表明，一方面B．suis的感染促进了Mφ泛素及蛋白酶体的表达；另一方面，泛素蛋白酶体系统功能的增强，显著降低了B．suis的早期感染，但对于B．suis感染中后期作用不明显，而感染后期抑制Mφ蛋白酶体功能，却可显著降低B．suis的胞内增殖能力。

表达绿色荧光蛋白猪种布鲁菌的构建

为了更直观的观察猪种布鲁菌在宿主细胞/宿主体内的活动规律,本研究首先应用PCR技术扩增pEGFP-N1质粒的N1基因,与pMD18-T载体连接后,成功构建PMD18-N1质粒;进而应用XbalⅠ与SacⅡ限制性内切酶,将PMD18-N1质粒与pBBR1MCS-6质粒分别进行双酶切,并将N1片段反向连接于PBBR1MCS-6载体上,经菌液PCR鉴定与双酶切鉴定,证明成功构建了PBBR1MCS-N1质粒;在此基础上,将PBBR1MCS-N1质粒电转化至猪种布鲁菌感受态细胞,通过含氯霉素的TSA培养基筛选、PCR鉴定、荧光鉴定及菌株的传代稳定性试验与培养特性的观察,最终获得了可稳定表达绿色荧光的猪种布鲁菌。