目的:建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法:人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚...目的:建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法:人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果:人PBMC用抗CD3 mAB刺激后15 m in,明显可见NF-κB活化,30 m in时达高峰,60 m in时降低。结论:EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。展开更多
目的构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达特点。方法用RT-PCR法扩增出TRIM22基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-N3,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定。将pEGFP-N3-TRIM22载体转染293T细胞,通过流式细胞仪...目的构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达特点。方法用RT-PCR法扩增出TRIM22基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-N3,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定。将pEGFP-N3-TRIM22载体转染293T细胞,通过流式细胞仪、荧光显微镜观察TRIM22-EGFP的表达;通过激光共聚焦,经Lyso Tracker Deep Red及DAPI分别染色溶酶体及细胞核,观察TRIM22-EGFP在293T细胞的分布特点。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体。流式细胞仪检测发现,转染细胞中TRIM22-EGFP+细胞约70%左右。荧光显微镜检测发现,TRIM22-EGFP在293T细胞中能以弥散、小斑点或大颗粒团块3种形式存在。激光共聚焦检测发现,在不同的293T细胞中TRIM22-EGFP可分别优势表达于细胞核、细胞浆,或者在胞核及胞浆均有大量表达。结论 TRIM22-EGFP能以弥散、小斑点或大颗粒团块形式分布于细胞核或细胞浆中。展开更多
文摘目的:建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法:人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果:人PBMC用抗CD3 mAB刺激后15 m in,明显可见NF-κB活化,30 m in时达高峰,60 m in时降低。结论:EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。
文摘目的构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达特点。方法用RT-PCR法扩增出TRIM22基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-N3,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定。将pEGFP-N3-TRIM22载体转染293T细胞,通过流式细胞仪、荧光显微镜观察TRIM22-EGFP的表达;通过激光共聚焦,经Lyso Tracker Deep Red及DAPI分别染色溶酶体及细胞核,观察TRIM22-EGFP在293T细胞的分布特点。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体。流式细胞仪检测发现,转染细胞中TRIM22-EGFP+细胞约70%左右。荧光显微镜检测发现,TRIM22-EGFP在293T细胞中能以弥散、小斑点或大颗粒团块3种形式存在。激光共聚焦检测发现,在不同的293T细胞中TRIM22-EGFP可分别优势表达于细胞核、细胞浆,或者在胞核及胞浆均有大量表达。结论 TRIM22-EGFP能以弥散、小斑点或大颗粒团块形式分布于细胞核或细胞浆中。