miR-142-5p通过影响紧密连接蛋白CLDN1的表达介导旋毛虫Ts-DNaseⅡ-7的肠屏障损伤作用

旋毛虫进入宿主后,脱囊幼虫(肠道感染性第1期幼虫)进入宿主的小肠上皮细胞内继续发育,是旋毛虫感染并致病的关键步骤。本课题组前期研究结果显示,旋毛虫成虫期Ts-DNaseⅡ-7蛋白通过影响肠屏障,促进旋毛虫侵入肠上皮细胞,从而有利于其在宿主体内寄生。并且,Ts-DNaseⅡ-7能够诱导多种miRNA出现差异化表达,有文献报道其中的miR-142-5p能够参与破坏肠屏障,因此本研究对Ts-DNaseⅡ-7诱导的miR-142-5p通过影响靶基因调控肠上皮细胞屏障功能的机制进行了探讨。试验分为Ts-DNaseⅡ-7处理组、miR-142-5p过表达组(OE)、miR-142-5p抑制组(Inhibition)、阴性对照组(NC)和空白对照组(Control),将miR-142-5p过表达及抑制表达的慢病毒载体,在MOI为80的条件下感染人结直肠腺癌细胞Caco-2,嘌呤霉素(8mg/L)筛选获得稳定抑制miR-142-5p表达及过表达miR-142-5p的细胞系,通过荧光显微镜评估细胞转染情况,采用RT-qPCR检测各组细胞miR-142-5p相对表达量;利用miRNA靶标预测数据库、RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶试验对目的基因进行预测和验证;再应用HE染色、Western blot和单层跨膜电阻(TEER)与FITC通透性定量分析阐明miR-142-5p的作用机制。结果显示:Caco-2细胞经慢病毒感染后,经荧光显微镜及RT-qPCR验证转染成功。此外,双荧光素酶和Western blot结果显示CLDN1是miR-142-5p的直接靶基因(P<0.001),与Ts-DNaseⅡ-7单独处理组和OE+Ts-DNaseⅡ-7组相比,抑制miR-142-5p表达组可缓解Ts-DNaseⅡ-7引起的CLDN1mRNA和蛋白水平下调(分别为P<0.01和P<0.05),并逆转TEER下降和通透性升高(P<0.01)。结果表明,Ts-DNaseⅡ-7可上调miR-142-5p的表达,引起Caco-2单层细胞CLDN1表达减少和肠屏障功能受损,进而促进旋毛虫入侵肠上皮,实现进一步发育。