对生孢梭菌CFU计数培养基的验证试验

目的:对新研制的生孢梭菌 CFU 计数培养基的 CFU 计数效果的可重复性进行验证。方法:将生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)复苏、增菌培养,培养物与标准比浊管比浊至相同浊度,然后10倍系列稀释至1×10^(-6),作为工作菌液。将工作菌液采用浇注法接种生孢梭菌 CFU 计数培养基,分别置厌氧条件及有氧条件35℃培养;将工作菌液采用涂抹法接种于营养琼脂培养基和厌氧菌琼脂培养基,置厌氧条件35℃培养,用未接种的培养基做空白对照。分别于18,24,48,72 h 进行 CFU·mL^(-1)计数、观察菌落形态。用同一工作菌液重复上述实验5次,分别计算不同培养基 CFU·mL^(-1)的平均值。将以上试验重复2次。结果:生孢梭菌 CFU 计数培养基的 CFU 计数结果明显优于营养琼脂培养基和厌氧琼脂培养基(P<0.01);厌氧条件培养明显优于有氧条件培养(P<0.01)。生孢梭菌以浇注法接种于 CFU 计数培养基,置厌氧条件35℃培养18 h,CFU·mL^(-1)计数最多,可能最接近最大活菌数,且菌落形态良好。结论:新研制的生孢梭菌 CFU 计数培养基可以认为是目前最适于生孢梭菌 CFU 计数的培养基,可以推荐作为生孢梭菌 CFU 计数培养基使用。

甲胎蛋白免疫测定用国家标准品的建立

甲胎蛋白(AFP)是一种血清糖基化蛋白,在正常成人血清中含量极少。AFP主要由胎儿卵黄囊和肝脏产生,其次是胃肠道黏膜、肾脏也可少量合成。AFP是单链糖蛋白,分子量65~70kD,其物理化学特性和氨基酸组成类似于血清白蛋白,但抗原性不同[1-3]。作为一种肿瘤标记物,AFP可以用于肿瘤的诊断疗效监控,70%~95%的原发性肝癌患者呈现AFP水平升高,AFP异常升高提示原发性肝癌的发生[4-7]。妊娠期可通过AFP监测进行疾病的筛查和诊断,产前普查羊水中AFP水平可监控胎儿异常,孕妇血清异常升高提示胎儿神经管缺陷畸形,如脊柱裂、无脑儿、脑积水等,AFP降低提示未出生的婴儿有唐氏综合征的危险性[8-11]。

抗A抗B血型定型试剂(单克隆抗体)国家参考品的建立

ABO血型系统是人类第一个血型系统,也是人类血型系统中抗原免疫性最强的[1]。至今人们已发现红细胞上有36个血型系统,300多种血型抗原。ABO血型系统是临床输血和器官移植中最重要的血型系统,对献血者和受血者ABO血型的预先确认是输血工作中最为重要的实验,错误的ABO血型定型将导致严重的输血反应[2-3]。

对《硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查(草案)》的验证试验

目的:对新提出的《硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查(草案)》的准确性、可操作性和可重复性进行验证。方法:将质控菌乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)、短芽孢杆菌接种于适宜的培养基培养,取新鲜培养物用0.9% 无菌氯化钠制成浊度稍高于标准比浊管的均匀菌液,然后分别用0.9%无菌氯化钠溶液进行系列稀释至约相当于10-100 CFU·mL-1,作为工作菌液。取上述工作菌液分别接种于3管(1 mL·管-1)硫乙醇酸盐流体培养基中,置35℃培养72h(短芽孢杆菌培养5 d)。同时将上述工作菌液进行CFU·mL-1计数:将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌采用涂抹法分别接种于血琼脂培养基和营养琼脂培养基,置有氧条件35℃培养24h,生孢梭菌采用浇注法接种于生孢梭菌CFU计数培养基,置厌氧条件35℃培养18-20 h,用未接种的培养基作为空白对照。结果:当上述3种质控菌工作菌液的平皿CFU计数在10-100 CFU·mL-1时,其接种的3管硫乙醇酸盐流体培养基均呈现生长。结论:新提出的《硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查(草案)》准确性、可操作性和重复性良好,易于推广和实施。可以提出作为对中国药典(2005年版)中硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查的修订草案。

对无菌试验培养基灵敏度试验法准确性的初步研究

目的:研究《中国生物制品规程》(2000年版)(简称《规程》)中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法的准确性。方法:按照《规程》中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法,同时采用平皿[乙型溶血性链球菌采用血琼脂平皿,短芽孢杆菌采用营养琼脂平皿,生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)采用硫乙醇酸盐软固体琼脂平皿(厌氧培养),白色念珠菌采用真菌培养基琼脂平皿]计数法,在相同稀释度及培养温度条件下平行进行1mL菌液的菌落形成单位(Colony Forming Units,CFU)计数。将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度,然后作10倍系列稀释。将稀释度为10-6～10-8的短芽孢杆菌、10-6-10-8的生孢梭菌,10-7～10-9的乙型溶血性链球菌菌液各1 mL,分别接种到9 mL硫乙醇酸盐培养基中;将稀释度为10-5～10-7的白色念珠菌菌液各1 mL,分别接种到9mL真菌培养基。每个稀释度至少接种3管,用未接种培养基作对照。将接种短芽孢杆菌的培养基,置35℃培养5 d,接种生孢梭菌或乙型溶血性链球菌的培养基,置35℃培养3 d,接种白色念珠菌的培养基,置25℃培养5 d,同时重复3次试验,记录结果。用每个菌种,按照需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法重复进行3次灵敏度试验。结果:按照《规程》中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法,同一种培养基,用同一质控菌种重复3次灵敏度试验,结果往往不同,尤其是用乙型溶血性链球菌进行质控时,更为明显。平皿CFU计数与比浊菌数常有显著差异。结论:《规程》中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法准确性欠佳。

我国部分地区庚型肝炎病毒(HGV)5'端部分基因序列的比较

采用套式逆转录聚合酶链反应（ＲＴｎＰＣＲ）法，用５′端引物对我国部分不同地区ＨＧＶＲＮＡ阳性的血清进行扩增，扩增产物为３９１ｂｐ，将其纯化后连接到ｐＧＥＭＴＥａｓｙ质粒上，然后进行测序。测序结果表明，５′非编码区可分为两部分，靠近５′端为保守区，靠近核心区５０ｂｐ为高度变异区，而靠近５′非编码区的部分核心区的序列也较为保守。５株中国南方ＨＧＶ的５′端基因序列与美国报道的ＧＢＶＣ和ＨＧＶ的同源性分别在８３．４％～８９．１％和８５．７％～９０．３％，而５株之间的同源性超过９１．４％，显示中国的ＨＧＶ不同于美国报道的ＧＢＶＣ和ＨＧＶ，而且在中国流行的ＨＧＶ之间的基因序列较为保守。

生孢梭菌CFU计数培养基的研制

目的:研制一种适宜生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)菌落形成单位(Colony Forming Units,CFU)计数的微生物培养基(简称培养基),使其CFU计数能够接近最大活菌数。方法:将生孢梭菌接种于硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂),置35℃培养24-48h;将生孢梭菌的新鲜培养物置无菌离心管中,500r·min^(-1)离心5min。取上层菌液,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至与标准比浊管相同浓度,并作10倍系列稀释至1×10^(-6)备用。将上述菌液分别浇注混匀于琼脂浓度为0.5%,0.6%和0.7%的3个生孢梭菌CFU计数研究培养基(简称3个生孢梭菌CFU计数研究培养基),置厌氧条件下35℃培养。优选18h进行CFU/mL计数并观察菌落形态,优选琼脂浓度为0.5%的上述培养基作为生孢梭菌CFU计数培养基并与其他5个培养基进行生孢梭菌CFU计数的比较试验。将上述菌液采用浇注法和L棒涂抹法接种于上述6个不同的培养基,置不同培养条件及培养时间进行生孢梭菌的CFU计数。结果:生孢梭菌CFU计数培养基,浇注法接种,在厌氧条件下35℃培养18h,CFU计数最多,且菌落形态良好,可能最接近最大活菌数。结论:新研制的生孢梭菌CFU计数培养基是目前最适于生孢梭菌CFU计数的培养基。

关于我国体外诊断试剂监督管理改革的建议

本文综述了美国、欧盟、日本、中国目前对体外诊断产品(试剂)监督管理的现状以及我国存在的问题。并根据我国具体情况提出了对体外诊断试剂监督管理的改革建议。

乙型肝炎病毒s基因变异株抗原表位的研究

对HepG2细胞表达的HBsAg的点突变体129Ha、142Lf、145Rb、143Sg和148及野生型HBsAgb3进行了初步纯化及抗原表位的研究，发现这些突变体的颗粒密度与野生型HBsAg差异无显著意义，约为1．2；用5种HBsAga决定簇的单克隆抗体对其表位进行分析，发现129Ha、142Lf、145Rb和142Sg与这5种单抗的结合力与野生型HBsAg差异大显著意义，但148突变体的表位与野生型HBsAg明显不同，其原因还有待进一步研究。

加快建设高通量测序标准数据库,实现全民“精准医疗”的标准化

目的:为我国高通量测序标准数据库的建设提供参考。方法:总结分析国内外高通量测序产品及数据库建设现状,剖析当前我国高通量测序标准数据库建设中亟待解决的问题。结果与结论:高通量测序是精准医疗重要的组成部分,国内外已批准多个高通量测序产品用于癌症等的临床诊治。但是,高通量测序能否在精准医疗中发挥更好的作用,还取决于是否有标准数据库用于准确地指导测序数据解读。随着高通量测序技术的发展,海量基因测序数据不断产生,如何建立中国人群基因变异解读标准数据库,用于评估和指导相关检测机构对致病基因的解读具有重大的现实意义。目前急需引入新的数据库建设及数据解读机制,为我国高通量测序行业的标准化健康发展及科学监管提供依据和保障。

2009年度甲胎蛋白(AFP)体外诊断试剂抽验质量分析

目的对14家企业的19批次的甲胎蛋白(AFP)体外诊断试剂进行评价,考察我国该类试剂的质量。方法依据产品注册标准和自拟标准对所有试剂进行检测。结果与结论 18批次试剂符合产品注册标准,自拟标准检测16批次试剂符合关于剂量反应曲线的线性相关系数的要求,16批次试剂符合准确性的要求,15批次试剂检测4份临床质控血结果差别显著(P<0.05)。各企业AFP体外诊断试剂产品注册标准存在差异,直接影响产品质量,建议加强该类标准的制修订工作,对三类体外诊断试剂的注册检验实行统一管理。

我国献浆血员中庚型肝炎病毒HGV RNA的检测及部分序列分析

采用５′非编码区的引物，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测１００名献浆血员中庚型肝炎病毒ＨＧＶＲＮＡ，其中１９名（１９％）ＨＧＶＲＮＡ阳性；对其中４份ＰＣＲ产物进行了直接测序，结果表明４株病毒在此区的核苷酸序列相对保守，其同源性在９５％以上，与美国报道的ＨＧＶ和ＧＢＶＣ的同源性分别为８８％和８５％不同。提示该４株ＨＧＶ与美国报道的ＨＧＶ和ＧＢＶＣ不属于同一基因型。

麦康凯山梨醇琼脂培养基的验证试验

目的对制订的麦康凯山梨醇琼脂培养基行业标准的可行性进行试验验证。方法取不同厂家生产的培养基,按照说明书配制待检培养基,根据行业标准要求,进行理化测定和微生物试验。结果待验证的麦康凯山梨醇琼脂培养基的pH值和水分等理化性质均在标准规定的范围内,且质控菌株生长情况符合相应要求。结论制订的麦康凯山梨醇琼脂培养基行业标准具有可操作性,可作为推荐性的行业标准。

硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂培养基行业标准验证

目的按照修订的硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖(TCBS)琼脂培养基行业标准中的要求进行试验,验证该行业标准的适用性。方法取不同厂家生产的TCBS琼脂培养基,根据TCBS琼脂培养基行业标准的要求,进行pH值、水分的测定和微生物生长试验。测定了TCBS琼脂培养基的pH值和水分,并将质控菌株的培养物接种到受试的培养基平皿中进行微生物生长试验。结果 TCBS琼脂培养基的pH值和水分均符合行业标准的规定,且各质控菌株生长良好。结论作为推荐性的国家行业标准,TCBS琼脂培养基行业标准可以用于我国该培养基的质量评价和监管工作的需要。

人类白细胞抗原B5801/5701/1502核酸检测国家参考品的建立

目的建立人类白细胞抗原B5801/5701/1502核酸检测国家参考品。方法采集HLAB5801/5701/1502阳性和阴性志愿者的新鲜外周血,经EB病毒转化,培养建立永生化细胞系。细胞扩增培养,提取基因组DNA,制备成国家参考品并经高通量测序验证。4家协作标定单位采用荧光PCR法、高通量测序(NGS)、基因测序分型(SBT测序法)对国家参考品进行定值,并进行国家参考品的复溶(在-20℃and 20~25℃之间反复冻融3次)稳定性和均匀性研究。结果 HLA-B5801/5701/1502核酸检测国家参考品成功制备,包含5例HLA-B5801阳性、3例HLA-B5701阳性、3例HLA-B1502阳性和9例阴性样本。该参考品定值准确,均匀性结果一致,参考品复溶3次后仍然稳定。结论人类白细胞抗原B5801/5701/1502核酸检测国家参考品的各项指标均符合要求,可用于HLA-B5801核酸检测试剂盒、HLA-B5701核酸检测试剂盒、HLA-B1502核酸检测试剂盒的性能评价。

人巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒国家监督抽验质量评价

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus,CMV）,属疱疹病毒科,乙组疱疹亚科,分子量为150×10~6 D,是直径为200 nm的线状双链DNA病毒,人是其唯一的宿主。巨细胞病毒的主要感染途径是与被感染病人接触,包括接触被感染病人的唾液、生殖器分泌物、尿液和乳汁,同时也可通过胎盘传播或发生医源性传染.

2018年体外诊断试剂国家监督抽验情况分析及对策建议

目的:对2018年体外诊断试剂国家监督抽验品种进行分析,为国家体外诊断试剂监督执法提供科学依据。方法:通过对体外诊断试剂品种进行梳理、汇总,从产品特点、标准现状、评估基础、法定检验、探索性研究、贯标统计等方面,评估各产品风险点,研究相关对策建议,为加强体外诊断试剂监管提供参考。结果与结论:2018年共完成10个体外诊断试剂品种352批监督抽验任务,合格334批,总合格率为94.9%,整体质量较好。但仍存在个别产品检验不合格,对国家标准和行业标准的理解和执行存在偏差,标签及说明书存在缺陷等问题,监管力度相对不足。建议通过加强贯标工作、合理制订抽验计划以及完善抽验模式等措施,加强体外诊断试剂的监督管理,提高我国体外诊断试剂监督抽验水平。

人淋巴细胞国家参考品的协作标定

根据卫生行业标准WS/T 360-2011《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[1]以及业内共识,通常使用白细胞分化抗原CD45/CD4/CD8/CD3/CD19/CD16和(或)CD56单一检测试剂或组合亚群检测试剂(流式细胞法),通过流式细胞术检测外周血或骨髓细胞表面的白细胞分化抗原(CD)表达,来分析不同亚群淋巴细胞的绝对计数和百分比[2-4]。

人淋巴细胞国家参考品的研制

目的制备人淋巴细胞国家参考品,用于人T/B/NK淋巴细胞亚群检测试剂的准确性评价。方法收集健康志愿者的新鲜外周血白细胞,采用人淋巴细胞分离液无菌分离得到外周血单个核细胞(PBMCs)。将PBMCs均匀重悬于细胞固定液,于2~8℃静置过夜。次日离心去除细胞固定液,加入适量冻干保护液重悬细胞。每支西林瓶按1 ml进行分装,分装后的细胞进行冻干,制备成人淋巴细胞国家参考品候选品。同时对候选品的分装均匀性、瓶间均匀性、基质效应和稳定性进行评价。结果成功研制出冻干型人淋巴细胞国家参考品,其均匀性和稳定性良好且无基质效应。结论人淋巴细胞国家参考品候选品各项指标均符合要求,可用于人T/B/NK淋巴细胞亚群检测试剂(流式细胞法)的准确性评价。

人类白细胞抗原B27核酸检测国家参考品的建立

目的建立人类白细胞抗原B27核酸检测国家参考品。方法采集HLA-B27阳性和阴性志愿者的新鲜外周血,经EB病毒转化,培养建立永生化细胞系。提取细胞基因组DNA,制备成国家参考品并经高通量测序验证。用4家协作标定单位的HLA-B27核酸检测试剂,采用荧光PCR法、PCR-SSP法、SBT测序法对国家参考品进行定值,并进行国家参考品的复溶(在-20℃和25℃之间反复冻融3次)稳定性和均匀性研究。结果成功制备HLA-B27国家参考品,包含3例HLA-B27阳性DNA样本和7例HLA-B27阴性DNA样本。经荧光PCR法、PCR-SSP法、SBT测序法协作标定,参考品定值准确。参考品均匀性结果一致,参考品复溶3次后仍然稳定。结论人类白细胞抗原B27核酸检测国家参考品的各项指标均符合要求,可用于人类白细胞抗原B27核酸检测试剂盒的性能评价。