中国优生及辅助生殖的挑战与出路

人类辅助生殖技术给我国日益增长的不孕不育患者带来了希望,但同时也增加了后代出生缺陷甚至成人疾病的发生风险。本文阐述了影响优生的配子、胚胎、母源因素以及辅助生殖安全性,旨在强调提升下一代健康水平应以配子/胚胎健康为本,可借助基因组学新技术降低遗传性出生缺陷发生率,防控胚胎发育源性成年病风险。

影响体外培养兔胚发育和兔类ES细胞分离的若干因素

本试验系统地比较了影响兔囊胚体外培养和免类ＥＳ细胞系分离的几个主要因素。结果表明，３种不同糖浓度（４．５，１．０，０．２ｇ／Ｌ）在４８ｈ内对胚胎贴壁均无显著影响。在高糖ＤＭＥＭ中，早期胚胎内细胞团（ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ，ＩＣＭ）增殖速度最快，分化也快；超低糖组，ＩＣＭ增殖缓慢，分化出现时间较晚；低糖组，ＩＣＭ既能保持较快的增殖速度，又能维持较长时间的未分化状。高糖组和低糖组的ＥＳ细胞样集落的传代能力相似，可达６～７代，超低糖组中不超过２代。胰岛素能促进ＩＣＭ的增殖，并可提高传代过程中ＥＳ细胞样克隆的形成率。在小鼠胚胎原代成纤维细胞（ＭＥＦ）和一种经白血病抑制因子转化了的小鼠成纤维细胞系（ＳＮＬ）上，ＩＣＭ都能维持较快的增殖速度，在家兔胚胎原代成纤维细胞（ＲＥＦ）中ＩＣＭ增殖较慢，无饲养细胞条件下，ＩＣＭ存活率低，生长状况不佳。传代能力，ＲＥＦ要比ＭＥＦ和ＳＮＬ低，且主要形成上皮样集落。作者根据以上实验结果认为，用低糖ＤＭＥＭ为基本培养基，再加入胰岛素，在ＭＥＦ或ＳＮＬ上培养切割胚胎和连续传代的技术路线是较为可行的。

猪导入人类促衰变因子(hDAF)的整合与表达

将人类促衰变因子 ( human decay accelerating factor,h DAF)基因显微注入 51 7枚猪的受精卵 ,移植到2 6头受体母猪的输卵管内。 2 1头怀孕 ,产仔 93头。产仔后 ,取仔猪的耳或尾组织 ,提取总 DNA。以 5′-TGGCGAGAAGGACTCAGTGATCT-3′和 5′-TGAACTGTTGGTGGGACCTTGGA-3′为引物 ,进行 PCR扩增 ,有 1 8头显示阳性。转基因效率为 3 .5%( 1 8/ 51 7)。对存活的 1 4头转基因猪用免疫荧光法进行检测 ,并采用 MPIAS-50 0多媒体彩色病理图文分析系统进行图像分析 ,其中有 7头的动脉肌肉层中显现有荧光 ,其平均灰度在 1 2 7.3～ 1 70 .

兔胚胎的一些与分离胚胎干细胞有关的生物学特征

为获得具有发育全能性的胚胎干细胞（ＥＳ细胞），对３日龄、３．５日龄和４日龄家兔胚胎的形态结构和免疫组化特征进行了观察。家兔胚胎的外围，不仅有透明带，还包有一层很厚的胶膜。３日龄兔胚为桑椹胚；３．５日龄胚胎已出现囊胚腔，囊胚腔较小，扩增内细胞团（ＩＣＭ）占据囊腔的１／２～２／３；４日龄为囊胚，囊腔扩大，ＩＣＭ与囊胚腔的体积比值缩小。桑椹胚的卵裂球和３．５日龄、４日龄胚胎的ＩＣＭ，以碱性磷酸酶染色和胚胎阶段特异性细胞表面抗原－１（ＳＳＥＡ－１）免疫荧光标记均呈强阳性，说明它们是由未分化的细胞构成。因此，从保证全能性的角度考虑，３日龄、３．５日龄和４日龄的家兔胚胎，均可用于ＥＳ细胞的分离。

家兔囊胚在饲养层上的生长行为

研究了家兔囊胚在饲养层上的生长行为。结果表明，滋养层细胞铺展后，形成一层透明的膜状结构。覆盖在内细胞团之上。内细胞团在培养４８小时后，可见到一定程度的增殖，第３天增殖速度加快。生长的内细胞团可呈团状、条状、网状和混合型四种形态。混合型内细胞团分化出现较早，呈团状、条状和网状生长的内细胞团分化较晚。团状内细胞团一般在原位生长，而呈条状和网状生长的内细胞团增殖很快并迅速扩展到各处。滋养层细胞覆盖于未分化的内细胞团表面，剥离滋养层后，内细胞团迅速分化，说明滋养层具有保护兔胚内细胞团，减小外界环境对其诱发分化的作用。

家兔桑椹胚和早期囊胚在饲养层表面的贴壁行为

探讨了不同状态家兔３日龄桑椹胚和４日龄囊胚在饲养层上的贴壁规律。结果表明，去除或保留透明带和胶膜的全胚贴壁最晚，离散胚在培养２４ｈ内即可贴壁，切割胚贴壁大多数发生于体外培养２４～４８ｈ之间。离散胚和切割胚都可能在培养１２ｈ后重新聚集成中空的亚囊胚结构。亚囊胚的贴壁过程是某一部位首先附着于饲养层表面，然后滋胚层铺展形成向下的拉力，使其全部贴壁。

新鲜周期与复苏周期囊胚移植效果的历史性队列研究

目的比较新鲜周期和复苏周期囊胚移植的相关参数及其临床结局。方法采用历史性队列研究方法,将2015年3月—2016年12月在第二军医大学长海医院生殖医学中心接受助孕治疗的患者分为新鲜周期囊胚移植组(61例)和复苏周期囊胚移植组(372例),收集其临床结局资料,比较两组患者的囊胚种植率和临床妊娠率。根据移植天数将复苏周期囊胚移植组分为第5天组(n=308)和第6天组(n=64)2个亚组,分析其临床结局的差异。结果新鲜周期和复苏周期囊胚移植组患者的年龄和移植囊胚数差异均无统计学意义,复苏周期囊胚移植组患者的囊胚种植率高于新鲜周期囊胚移植组(40.2%vs 29.6%,P=0.036),但两组患者的临床妊娠率差异无统计学意义(57.8%vs 47.5%,P=0.134)。复苏周期囊胚移植第5天组患者的囊胚种植率和临床妊娠率均高于第6天组(囊胚种植率42.3%vs 30.1%,P=0.016;临床妊娠率60.7%vs 43.8%,P=0.012)。结论复苏周期囊胚移植可比新鲜周期囊胚移植获得更好的妊娠结局,且第5天移植者比第6天移植者效果更佳。

胚胎干细胞分离培养的影响因素

ＥＳ细胞体外生长的环境要求极为苛刻，原则上应满足两个条件：①促进细胞的分裂增殖；②抑制细胞的分化。前者受到基本培养基、添加剂、血清和生长因子的影响，后者则涉及到动物早期胚胎的胚龄和饲养层细胞种类的选择、条件培养基和生长因子的运用以及其它类型细胞（如滋胚层细胞）的影响。不同动物胚胎在体内发育有不同特点，对体外生长的环境要求不同，针对不同动物，应采取相应的策略，才能建立起真正的ＥＳ细胞。

不同因素对小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的影响

[目的]研究在不同条件下小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的变化，为卵母细胞纺锤体的研究提供参考依据。[方法]在不同条件下处理小鼠MⅡ期卵母细胞，通过免疫细胞化学方法和激光共聚焦扫描显微镜观察其纺锤体变化。[结果]卵母细胞在25℃、20min时纺锤体异常，25℃、30min或4℃、10min时纺锤体缺失；5、10、20和40μg/ml细胞松弛素B（CB）作用2h未对纺锤体产生影响；卵母细胞在20μmol／L秋水仙素中作用1h纺锤体异常，40μmol／L时作用1h纺锤体缺失；在4％多聚甲醛中4℃条件下，卵母细胞纺锤体结构以固定时间为1～12h效果较好。[结论]小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体对外界环境变化敏感，体外操作时控制外部环境是保持卵母细胞纺锤体正常生理功能的关键。

生发泡移植过程对小鼠卵母细胞体外受精的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,本试验比较了GV移植过程及体外成熟对小鼠卵母细胞体外受精的影响。通过透明带切口及GV移植获得的重组GV期卵母细胞的成熟率为87.0%(147/169),体外受精后发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率分别为76.2%(112/147)和42.2%(62/147),与仅做透明带切口但不进行GV移植的对照组相似(P>0.05),表明GV移植过程未对卵母细胞体外受精后的早期胚胎发育能力产生不利影响。但与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率都明显降低,表明其进一步发育的能力受到影响。

与衰老相关的母源性生育力下降

老龄妇女与雌性动物生育力下降和丧失的原因包括卵母细胞库减少以及卵巢、输卵管和子宫的结构和功能障碍 ,但由减数分裂错误引起的卵母细胞质量下降是与衰老相关的母源性生育力下降的主要原因之一。卵母细胞的减数分裂错误主要表现为非整倍性和染色单体提前分离。本文主要综述了影响母源性生育力的各种因素、老龄动物卵母细胞减数分裂错误的原因、纺锤体和染色体改变的机制以及小鼠作为研究妇女年龄与生育力相互关系的动物模型等问题。

不同培养液对卵母细胞体外成熟及重组卵母细胞孤雌活化的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了几种培养液对GV期卵母细胞体外成熟和重组卵母细胞孤雌活化的影响.自然获得的GV期卵母细胞和经显微操作获得的重组卵母细胞在M2、HTF和M199培养液培养,其体外成熟率无差异(P>0.05);但成熟的重组卵母细胞经人工活化后,生长在HTF培养液的细胞发育到2-细胞期胚的比率(49.2%)明显高于生长在M199培养液的比率(28.9%)(P<0.05).结果表明HTF培养液更适合小鼠卵母细胞的体外成熟和进一步发育.

年轻与老龄小鼠未成熟卵母细胞之间的生发泡移植

为研究不同年龄来源的细胞质或细胞核对卵母细胞成熟、钙振荡及核型的影响，在6罐周龄（6w）小鼠与9月龄（9M）和12月龄（12M）小鼠卵母细胞之间进行了生发泡（GV）互换。通过显微操作和电融合获得了5组重组卵母细胞。重组卵母细胞和对照卵母细胞经Sr^2＋诱导后呈现相似的钙震荡模式。6WGV-6W胞质体组、6WGV-9M胞质体组和6WGV-12M胞质体组成熟卵母细胞染色单体提早分离的比率与6～8周龄对照组比较无差异（P〉0.05），但显著低于12月龄对照组（P〈0．01）。而9MGV-6W胞质体组和12MGV-6W胞质体组成熟卵母细胞染色单体提早分离的比率则明显增加。这些结果表明由年轻与老龄小鼠之间GV互换所重组的卵母细胞能够正常成熟和产生钙震荡，与衰老相关的减数分裂异常似乎归因于细胞核或染色体而不是细胞质。

小鼠卵母细胞体外成熟不同阶段对钙的依赖性

本研究旨在探讨小鼠卵母细胞成熟与钙和钙调素的关系。研究发现,20μmol/L W7、50μM BAPTA/AM对GVBD发生没有影响,但阻断了中期Ⅰ的卵母细胞进入中期Ⅱ。通过测定成熟不同阶段细胞内钙的分布,发现GVBD后染色体周围区域有较高水平的钙分布,并且该现象能被加BAPTA/AM而消除。GVBD发生后6h左右高钙分布现象消失。我们还测定了成熟过程中MPF活性的变化,20μmol/L W7、50μmol/L BAPTA/AM对卵母细胞成熟过程中MPF活性的升高没有影响。结果表明:小鼠卵母细胞GVBD的发生不依赖钙和钙调素;钙和钙调素对中期Ⅰ的发育是必需的,并且核周区钙分布可能起着重要作用。

人精浆中胎盘生长因子表达与少弱精子症临床相关性分析

目的探究人精浆中胎盘生长因子(PlGF)的表达水平及其与精子质量的相关性,以及其在少弱精子症和无精子症中的临床意义。方法选择2014年9月至11月于第二军医大学长海医院生殖医学中心行精液检测的88例患者,根据检测结果分为3组:10例精液正常者、68例少弱精子症患者以及10例无精子症患者。对其中5例精液正常者和5例少弱精子症患者的精浆样本进行细胞因子相关蛋白质芯片检测。利用ELISA法检测精浆中PlGF的含量,运用Pearson相关性分析研究精浆中PlGF含量与精液中精子浓度和活力、患者年龄的相关性。结果精液正常组患者精浆中PlGF含量高于少弱精子症组和无精子症组(P<0.05)。精浆中PlGF含量与精子的浓度和活力均存在相关性(r=0.362、0.253,P均<0.05),与患者的年龄无明显相关性。结论精浆中PlGF含量与精子的浓度存在相关性,临床上可为少弱精子症和无精症的诊断和治疗提供参考。

不同年龄昆明白小鼠卵母细胞的生发泡互换

为探讨卵母细胞减数分裂异常及其与年龄相关变化之间的关系,对不同年龄段昆明白小鼠卵母细胞进行了生发泡(GV)移植研究.应用显微操作和电融合技术,将6～8周龄小鼠GV期卵母细胞分别与6月龄、9月龄和12月龄小鼠GV期卵母细胞进行GV互换,所形成的6种GV-胞质体复合体的融合率(89.7%～95.6%)和6种重组卵母细胞的成熟率(83.5%～88.2%)并不因小鼠年龄的改变而有所变化.成熟的6种重组卵母细胞经体外受精后,形成原核期胚和2-细胞期胚的比率(分别为80.0%～87.3%和42.7%～50.9%)并不因不同年龄小鼠卵母细胞GV互换所带来的细胞质或细胞核的改变而受到影响.

年龄、成熟方式及培养液对小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响

为研究卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了年龄、成熟方式及培养液对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响.1.5月龄、3月龄、6月龄、9月龄和12月龄小鼠的GV期卵母细胞其体外成熟率无差异(P>0.05).经人工活化后,与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率都明显降低;体外成熟的生长在HTF培养液的卵母细胞发育到2-细胞期胚的比率(44.4%)显著高于生长在M16培养液的比率(22.9%)(P<0.01).结果表明昆明白小鼠卵母细胞的体外成熟不受年龄影响,体外成熟的卵母细胞人工活化后支持发育的能力比体内成熟的差,HTF培养液更适合小鼠卵母细胞人工活化后的进一步发育.

昆明白小鼠卵母细胞的生发泡移植

为探讨细胞核与细胞质调控减数分裂的机制,对昆明白小鼠GV期卵母细胞进行了GV移植研究.将6～8周龄小鼠GV期卵母细胞分别与6～8周龄和3月龄小鼠GV期卵母细胞进行GV互换,所形成的3种GV-胞质体复合体的融合率(85.0%～89.8%)和3种重组卵母细胞的成熟率(93.9%～96.2%)并不因小鼠年龄的改变而有所变化.经人工活化后,3种重组卵母细胞形成原核期胚和2-细胞期胚的比率(分别为80.5%～85.4%和51 2%～55 4%)也不因不同年龄小鼠卵母细胞所带来的细胞质或细胞核的改变而受到影响.细胞遗传学分析表明成熟的重组卵母细胞表现出正常的核型.

哺乳动物卵母细胞生发泡移植

生发泡(GV)移植是指将GV期卵母细胞的GV移入到去核的受体细胞(GV期卵母细胞、MII期卵母细胞或受精卵)透明带下,经融合形成一个重组卵的过程。GV移植对研究卵母细胞的细胞周期调控、成熟及受精时细胞核与细胞质之间的相互作用非常重要,可用于研究卵母细胞减数分裂异常和与年龄相关变化之间的关系及细胞质衰老与卵母细胞非整倍性之间的关系。现简要介绍了GV移植的基本程序,GV核体与胞质体的融合,重组卵的培养条件,重组卵成熟后的受精、人工激活和胚胎发育能力以及GV移植的意义。

短时IVF联合早期补救ICSI与half-ICSI预防初次助孕周期受精低下的比较

目的对比分析短时体外受精(IVF)或短时IVF联合早期补救卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)与部分卵胞浆内单精子显微注射(half-ICSI)两种授精方式在首次助孕周期对预防IVF受精率低下的疗效。方法回顾性分析2015年5月1日—2016年12月31日初次助孕周期中因存在精卵结合障碍高危因素而接受短时IVF(或短时IVF联合联合早期补救ICSI)或half-ICSI预防IVF受精率低下患者的病例资料。根据授精方式分为短时IVF助孕组(A组,n=192)和half-ICSI助孕组(B组,n=85),比较两组患者的一般情况、受精情况、胚胎发育以及接受新鲜胚胎移植后的妊娠结局。为进一步分析受精情况,筛选A、B两组中IVF受精率低下周期(受精率≤30%)的患者,分别设为A1组(n=20)和B1组(n=9),比较A1、B1两组的卵子受精情况。结果与B组相比,A组不存在过度ICSI(0.0%vs89.8%,χ~2=479.888,P<0.01)。A组正常受精率低于B组(73.3%vs 79.6%,χ~2=14.780,P<0.01),但两组可用胚胎率、优质胚胎率、囊胚形成率以及接受新鲜胚胎移植后临床妊娠率、胚胎着床率、流产率差异均无统计学意义(P均>0.05)。IVF受精率低下周期中,短时IVF联合早期补救ICSI可提高正常受精率(A1组77.9%,B1组49.4%,χ~2=28.833,P<0.01)。结论相比half-ICSI,短时IVF联合早期补救ICSI可避免过度ICSI、提高IVF受精率低下周期的正常受精率,预防IVF受精率低下更加精确、有效。