长白山白眉蝮蛇蛇毒酶的基质辅助激光解吸质谱分析

用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法对长白山眉蝮蛇蛇毒所含4种主要酶:磷脂酶A_2、精氨酸酯酶、纤溶酶及L-氨基酸氧化酶进行了纯度鉴定和分子量测定,结果表明WALDI-TO-FMS具有灵敏度高、分辨能力强、分析时间短及样品用量少等优点.用MALDI-TOFMS法分析蛇毒酶的纯度和分子量简捷、快速且重现性好,是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所无法比拟的.

血清胃蛋白酶原及其比值在胃癌早期诊断中的价值

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于其早期常缺乏特异性表现，当出现明显消化道症状时，病情已进展为中、晚期，失去最佳的治疗时机。目前临床上对胃癌的诊断主要以胃镜检查为主，但对亚临床患者尚不能作为普查手段。近年来已有多名学者报道了血清胃蛋白酶原（PG）测定作为胃癌初步筛查的有效性，本文通过检测26例浅表性胃炎、28例萎缩性胃炎、32例胃溃疡、29例胃癌患者和44例健康体检者血清中胃蛋白酶原（PGI、PGR）水平，以探讨其在胃癌早期诊断中的价值。

长白山白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶的纯化

从长白山白眉蝮蛇蛇毒中纯化具有溶栓功效的纤溶酶。方法：用 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０离子交换、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ７５凝胶过滤层析和 ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ ５０三步柱层析分离方法，对长白山白眉蝮蛇蛇毒进行分离纯化，得到了一种纤溶酶活性组分。结果：经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征该酶为单一蛋白，其分子量为 ２３．３６７ ｋＤ。结论：为进一步研究其结构和功能提供了可靠依据。

白眉蝮蛇蛇毒及蛇毒酶的激光解吸飞行时间质谱研究

In this paper, three kinds of snake venoms and four kinds of enzymes (phospholipase A 2, fibrinolytic enzyme, arginine esterase and L amino acid oxidase) isolated from the snake venom were analyzed. As the snake venom was different, the MALDI/TOF/MS showed difference. The MALDI/TOF/MS determination results could be affected by the concentrations of snake venom enzymes. And the mechanisms of desorption and ionization was also given in this study. By using MALDI/TOF/MS we obtained the accurate molecular weights and homogeneities of the enzymes. The apparent characteristics of the positive MALDI/TOF/MS of enzymes composed by two subunits were also given out. The results showed that MALDI/TOF/MS is an effective analytic method for discovering new components from snake venom complexes. And it is reliable to use this method to determine the molecular weights and purifies of protein molecules. [WT5HZ]

白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化与表征

用离子交换和凝胶过滤层析技术从长白山白眉蝮蛇蛇毒（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｂｌｏｍｈｏｆｆｉｕｓｕｒｅｎｓｉｓ）中分离得到了Ｌ氨基酸氧化酶（Ｌａｍｉｎｏａｃｉｄｏｘｉｄａｓｅ），经ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）和基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）鉴定，发现Ｌ氨基酸氧化酶由两个不相等的亚基组成，一个亚基的分子量约为３６０００，另一个亚基分子量约为５７０００．以Ｌ亮氨酸作为底物进行Ｌ氨基酸氧化酶活力测定时发现，其反应的适宜ｐＨ值为４５５和８９。

MALDI/TOF MS法测定蛇毒纤溶酶及磷脂酶A_2的分子量和纯度

目的： 分析测定长白山白眉蝮蛇蛇毒纤溶酶和磷脂酶Ａ２ 的分子量和纯度。方法与结果： 应用ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ 法测定纤溶酶的分子量为２３ ３３３ ±９０ ， 磷脂酶Ａ２ 的分子量为１４ ０００ ±２０ ， 相对偏差在０－３８ ％ 以内。结论： 应用此方法未检测到杂蛋白质谱峰的存在， 酶的纯度较好， 测得结果要比电泳法准确。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ提供了一种测定蛋白质药物纯度快速准确的新方法。

2D-DIGE-HPLC-nESIMS/MS对2,4-二硝基苯磺酸损伤HaCaT细胞差异蛋白质的鉴定

采用Cy2、Cy3和Cy5荧光染料标记蛋白,建立了人角质形成细胞HaCaT受2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)刺激前后的双向胶内差异凝胶电泳(2D-DIGE)图谱,每组平行样本数为3。凝胶采用蛋白荧光染料Deep Purple进行后染色(Post-stain)。DeCyder定量分析软件在每块凝胶上平均检测到1 200个以上蛋白斑点,每块胶上都匹配得到的相同蛋白质斑点有846个。其中有7个斑点丰度变化在50%以上,统计学意义显著(P值小于0.05)。利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI MS/MS)成功鉴定5个表达上调的斑点分别为X染色体开放阅读框26(Cxorf26)、人辅分子伴侣23(PTGES3)、钙调蛋白(CALM3)、肌球蛋白轻链6(MYL6)和断裂点丛集区蛋白1(BANF1);2个表达下调蛋白斑点被鉴定为转录延伸因子B肽链2(TCEB2)和核糖体蛋白L23(RPL23)。除MYL6被报道与皮肤疾病相关外,其它蛋白与皮肤病变的关系有待研究。该研究得到的7个差异表达蛋白为DNBS类化学致癌物职业接触者皮肤病变研究提供了有价值的线索。

鼠肝癌淋巴道转移细胞模型的蛋白质组学研究

对2株来源于同一亲本细胞但淋巴道转移力显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-F(淋巴结转移率75%)和Hca-P(淋巴结转移率25%),采用荧光差异双向凝胶电泳(2D DIGE)和DeCyder定量分析软件及HPLC-nESI-MS/MS技术,定量分析和鉴定了小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P的差异表达蛋白.结果显示,有116个蛋白质点表达水平存在明显差异(p<0.05),在Hca-F中表达上调蛋白质点62个,下调蛋白质点54个.对所有116个蛋白质点进行了电喷雾串联质谱鉴定,共鉴定出109种单一(Unique)蛋白.其中部分蛋白已被报道与不同类型肿瘤的发生、浸润和转移相关,多数蛋白质被首次报道与肝癌的淋巴道转移过程直接相关.

2型糖尿病患者单核细胞亚群CD36水平与Lp-PLA2表达的研究

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者单核细胞亚群CD36在促进脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)分泌中的作用。方法选择2018年1—11月在盐城市第三人民医院就诊的T2DM患者50例作为T2DM组。T2DM组包括T2DM合并动脉粥样硬化(As)24例和无As 26例,健康对照组26例(HC组)。流式细胞术(FCM)检测外周血单核细胞亚群CD36平均荧光强度(MFI);分选单核细胞亚群,诱导成巨噬细胞,FCM检测其摄取Dil-氧化低密度脂蛋白(ox-LDL);oxLDL刺激24 h,化学发光法检测上清液Lp-PLA2浓度。结果与HC组相比,T2DM患者中间型单核细胞CD36 MFI升高,且与血清Lp-PLA2浓度呈正相关(P<0.05),合并As患者升高更显著(P<0.05)。T2DM患者中间型单核细胞诱导的巨噬细胞摄取Dil-ox-LDL和分泌Lp-PLA2高于HC组(P<0.05),此作用被CD36阻断性抗体抑制。结论T2DM患者中间型单核细胞高表达CD36,摄取较多的ox-LDL,促进细胞分泌Lp-PLA2,参与动脉粥样硬化(As)的形成。

长白山白眉蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶1的研究Ⅰ.纯化、分子量测定及纯度鉴定

利用离子交换 (DEAESephadexA - 50 )和凝胶过滤层析 (SephadexG - 75)技术首次从长白山白眉蝮蛇蛇毒 (AgkistrodonblomhoffiiUssurensis)中纯化得到了一种精氨酸酯酶纯品。经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI/TOF/MS)鉴定为单一纯蛋白 ,分子量为2 991 8.5± 1 5Da ,为进一步研究其结构与功能提供了可靠的依据。

糖耐量减低患者血清胎球蛋白A水平升高

目的观察糖耐量减低(IGT)患者血清胎球蛋白A(fetuin-A)水平变化的意义。方法用ELISA法检测63例IGT患者、61例2型糖尿病(T2DM)患者及42例糖耐量正常(NGT)者血清胎球蛋白A水平;测定体质指数(BMI)、腰臀比(WHR)、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2hPBG)、糖化血红蛋白A1c(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹胰岛素(FIns)及C反应蛋白(CRP);用稳态模型计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果 IGT组血清胎球蛋白A[中位数(四分位数)]水平[298.1(242.4,347.5)μg/mL]高于NGT组[251.6(197.3,304.8)μg/mL],P<0.05,低于T2DM组[345.1(308.7,393.9)μg/mL],P<0.05;IGT组中,血清胎球蛋白A水平与FBG(r=0.385,P<0.01)、2hPBG(r=0.432,P<0.01)及LDL-C(r=0.187,P<0.05)呈正相关,与年龄(r=-0.516,P<0.01)呈负相关,与其他指标无相关性(P>0.05)。结论胎球蛋白A与糖脂代谢紊乱有相关性,可能通过调节糖脂代谢参与T2DM的发生发展。

中波紫外线与化学致癌物诱导下HaCaT细胞的蛋白表达应答

对角质形成细胞HaCaT分别进行中波紫外线(UVB)照射、2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)刺激及UVB+DNBS(UD)共同刺激,利用二维荧光差异胶内凝胶电泳(2D DIGE)、DeCyder定量分析软件和HPLC-nESI-MS/MS分析技术,对HaCaT细胞产生的差异表达蛋白进行了鉴定.有65个蛋白质点发生了明显表达差异(P<0.05),与UVB或DNBS单独处理细胞相比,有41个蛋白点表现为UVB和DNBS的正协同效应,13个蛋白点表现为负协同效应,5个蛋白点与UVB单独处理相近,6个蛋白点与DNBS单独处理相近.HPLC-nESI-MS/MS从65个差异表达蛋白质点中共鉴定出60种单一(Unique)蛋白.采用生物信息学方法对这些鉴定蛋白所涉及的分子功能、参与的生物学过程及信号通路进行了系统分析.实验得到了与紫外辐射和化学诱导损伤的直接相关蛋白,有助于研究不同环境条件下皮肤癌的形成及皮肤疾病的有效防护与治疗.

长白山白眉蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶1的研究Ⅱ.酶学性质和荧光光谱研究(续Ⅰ)

测得了长白山白眉蝮蛇毒精氨酸酯酶 1的最适反应的pH范围为 7.0～ 8.0 ,且与酶反应底物对甲苯磺酰-L -精氨酸甲酯 (TAME)的反应无明显的最适应反应温度 .荧光光谱的研究结果表明 :该酶的酪氨酸残基的荧光被色氨酸残基的荧光所掩盖 ;同步荧光光谱结果表明 :当发射波长与激发波长差Δλ分别为 2 0nm和 75nm时 ,精氨酸酯酶 1的荧光光谱分别由酪氨酸 (Tyr)和色氨酸 (Trp)残基所贡献 ,且处于亲水性环境中 ;精氨酸酯酶 1的荧光发射强度受溶液酸度变化的影响 .I- ,Acr和NBS对精氨酸酯酶 1的荧光淬灭结果表明这种酶中含有多个色氨酸残基 ,且处于不同的微环境中。

长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A_2的荧光光谱

利用荧光光谱系统研究了长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶Ａ_２的荧光特性。研究结果表明：当发射波长与激发波长差为２０ｎｍ和７５ｎｍ时，ＰＬＡ２的同步荧光分别主要由酪氨酸（Ｔｙｒ）残基和色氨酸（Ｔｒｐ）残基所贡献。缓冲溶液的酸度变化能够明显影响ＰＬＡ２氨基酸侧链的电荷分布，从而改变 ＰＬＡ２的荧光发射强度。金属离子Ｃａ２＋一方面能增强ＰＬＡ２的荧光强度，另一方面也能够加快ＰＬＡ２与底物二棕榈酸磷脂酰胆碱（ＤＰＰＣ）的反应速度。

参麦注射液合并香丹注射液治疗慢性乙型肝炎的疗效观察

用参麦注射液合用香丹注射液治疗慢性乙型肝炎,取得了较满意的结果,两药合用可有效地提高机体免疫力,改善微循环,减轻肝细胞炎症和坏死,恢复肝细胞功能。

HBsAg定量与HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人抗病毒治疗效果的关系

目的分析HBsAg定量的动态变化和HBeAg血清转换率的关系,探讨HBsAg定量对干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人效果的预测价值。方法 HBeAg阳性慢性乙型肝炎病人87例,根据病人的意愿分为干扰素组(49例)和拉米夫定组(38例),分别应用干扰素和拉米夫定治疗48周。分别于治疗前,治疗12、24、36、48周检测血清HBsAg、HBeAg和HBeAb定量水平,分析治疗12周时HBsAg水平的下降幅度与治疗48周时HBeAb/HBeAg比值的相关性。结果拉米夫定组HBsAg定量水平在治疗过程中变化不明显,干扰素组HBsAg定量水平在治疗过程中进行性下降(F=15.112,P<0.01)。拉米夫定组和干扰素组比较,治疗前HBsAg定量水平差异无显著性(P>0.05);治疗12、24、36、48周干扰素组HBsAg定量水平低于拉米夫定组,差异有显著性(t=2.292～9.664,P<0.05)。拉米夫定组治疗12周时HBsAg水平下降幅度与48周时HBeAb/HBeAg比值无相关性(r=0.385,P>0.05),而干扰素组治疗12周时HBsAg水平下降幅度与48周时HBeAb/HBeAg比值呈正相关(r=0.322,P<0.05)。结论治疗12周时血清HBsAg水平下降幅度对于干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎效果有一定的预测价值。

肺腺癌原位癌及转移癌的定量蛋白质组学的初步研究

背景与目的采用建立在荧光差异双向凝胶电泳技术上的定量蛋白质组学方法高通量筛选与肺腺癌以及肺腺癌转移癌临床相关的差异性蛋白，为寻找肺癌的早期诊断、肺癌转移以及肺癌治疗的潜在蛋白标靶奠定方法基础和提供蛋白标记物。

胶内差异双向电泳-电喷雾串联质谱筛选UVB损伤皮肤细胞潜在的蛋白质靶标

联用胶内差异双向电泳(2D-DIGE)和高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI MS/MS)鉴定人角质形成细胞HaCaT应答中波紫外线(UVB)损伤的差异表达蛋白,筛选UVB影响皮肤细胞正常生理功能潜在的靶标蛋白。结果表明:UVB辐射明显影响HaCaT细胞的蛋白质表达谱,DeCyder软件在每块DIGE凝胶上平均检测到1 200多个蛋白斑点,在DIGE检测限以上有显著性表达差异的斑点有41个。HPLC-nESI MS/MS成功鉴定了9个差异表达最显著斑点,4个表达上调斑点被鉴定为26S蛋白酶体亚基p40.5(PSMD13),组织蛋白酶D(CTSD),6-磷酸葡糖酸内酯酶(PGLS),辅分子伴侣23(PTGES3);5个表达下调斑点被鉴定为层粘连蛋白受体1(RPSA),干扰素-γ诱导因子前体(IL18),钙调蛋白(CALM3),60S酸性核糖体蛋白P2类似物(RPP2)和断裂点丛集区蛋白1(BANF1)。9个差异表达蛋白中,除RPSA、CALM3和CTSD被报道与皮肤烫伤和创伤修复、角质形成细胞增殖和迁移、表皮障碍修复相关外,其他蛋白与皮肤细胞损伤和皮肤疾患研究未见报道。这些蛋白是UVB辐射直接影响皮肤细胞正常生理功能潜在的蛋白质靶标,为进一步在分子水平研究皮肤疾病有效防护提供了有价值的线索。

HPV18 E7致癌蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的为进一步研究人乳头状瘤病毒18(Human papillomavirus 18,HPV18)E7蛋白的结构与功能。方法构建HPV18 E7的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白质粒pGEX-6P-1-GST-HPV18E7,重组质粒转入大肠埃希菌BL21进行可溶性融合蛋白的高效表达。结果柱上切除法去除GST标签,表达产物经glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化,获得了SDS-PAGE和HPLC-ESI-MS纯度的HPV18 E7均质蛋白,非变性PAGE和凝胶过滤表明HPV18 E7以稳定的单体形式存在于水溶液中。高压液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)分析得到HPV18 E7精确分子量为12865.0 Da,与其理论值吻合。纯化蛋白经HPLC-ESI-MS/MS鉴定为目的产物,鉴定出的9个匹配肽段覆盖率为HPV18 E7整个氨基酸序列的96.5%。结论本文所建立的技术可以有效地大量制备HPV18 E7,为进一步研究其结构与功能和致癌机制奠定了重要的物质基础。

采用定量蛋白质组学技术筛选小鼠肝癌淋巴道转移相关蛋白

淋巴道转移是上皮来源恶性肿瘤转移的早期阶段,其发生机制不清,一直是肿瘤学研究面临的难题,为寻找淋巴道转移相关蛋白,以一对来源于同一亲本细胞,且淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水型细胞株为研究对象,其中Hca-F为高淋巴道转移力细胞株,Hca-P为低淋巴道转移力细胞株,采用定量蛋白质组学技术——荧光差异双向凝胶电泳,建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤淋巴道转移相关的蛋白质.经DeCyde软件分析,共得到163个有统计学差异的蛋白质点,选择2倍以上的差异性蛋白质点23个,经质谱鉴定得到17个蛋白质,在Hca-F中高表达的蛋白质有7个:转羟乙醛酶、波形蛋白、肌酸激酶(脑)、膜联蛋白7、膜联蛋白5、烯酰辅酶A水合酶1(过氧化物酶体)、核内异质核糖核蛋白A2/B1异构体1.而在Hca-F中低表达的蛋白质有10个:真核翻译延长因子2、Ero1样蛋白、乙醛脱氢酶2(线粒体)、苹果酸盐脱氢酶2(NAD)、β-内酰胺酶2、谷胱甘肽S转移酶"1、泛素C末端水解酶同工酶L3、内质网蛋白29(前体)、溶血磷脂酶1、微管不稳定蛋白.这些差异性蛋白质的功能涉及到代谢、蛋白质分泌、蛋白质结合、核苷酸结合,钙离子结合、凋亡和调节生长等过程.对这些蛋白质功能的进一步验证,将有助于解析肿瘤淋巴道转移的分子机制.