原发性血小板增多症患者中JAK2、CALR及三阴性驱动突变的临床特征比较

目的:探讨原发性血小板增多症(ET)患者的突变基因与临床特征的关系。方法:对2018年10月至2022年3月69例ET患者的临床资料进行回顾性分析。将患者按突变的驱动基因类型分为JAK2组、CALR组与三阴性组,对3组患者的性别、年龄、心血管危险因素、血栓、脾肿大、血常规、凝血状态进行分析。结果:69例ET患者中,46例伴随JAK2基因突变,14例伴随CALR基因突变,8例为三阴性,1例伴随MPL基因突变。3组患者的年龄、性别无显著差异(P>0.05)。JAK2组血栓率最高,为26.09%(12/46),三阴性组为12.5%(1/8),CALR组无血栓事件。JAK2组伴随脾肿大发生率最高,为34.78%(16/46),而三阴性组无脾肿大发生。JAK2组的白细胞数为(9.00±4.86)×10^(9)/L,显著高于CALR组的(6.03±2.32)×10^(9)/L(P<0.05)。JAK2组的血红蛋白含量为(148.43±18.79)g/L,显著高于三阴性组的(131.00±15.17)g/L(P<0.05)。JAK2组的红细胞压积为(0.44±0.06)%,亦显著高于三阴性组的(0.39±0.05)%(P<0.05)。JAK2组血小板数为(584.17±175.77)×10^(9)/L,显著低于CALR组的(703.07±225.60)×10^(9)/L(P<0.05)。JAK2组和三阴性组纤维蛋白原含量分别为(2.64±0.69)g/L和(3.05±0.77)g/L,均显著高于CALR组的(2.24±0.47)g/L(P<0.05,P<0.01)。三阴性组活化部分凝血活酶时间为(28.61±1.99)s,较CALR组的(31.45±3.35)s显著降低(P<0.05)。结论:不同驱动基因突变ET患者的血细胞计数与凝血状态存在差异。与CALR组相比,JAK2组血栓率、白细胞数和纤维蛋白原含量均显著升高,而血小板数显著降低;与三阴性组相比,JAK2组脾大发生率和红细胞压积显著升高;与CALR组相比,三阴性组的纤维蛋白原含量显著升高、活化部分凝血活酶时间显著降低。

补阳还五汤治疗大鼠气虚血瘀型脑缺血的代谢组学研究

目的:探讨补阳还五汤对气虚血瘀型脑缺血大鼠生物代谢途径的影响。方法:将30只大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组(3.49 g/kg)。模型组和补阳还五汤组采用荧光微球诱导多发性脑梗死合并睡眠剥夺,建立气虚血瘀型脑缺血动物模型,并分别给予蒸馏水或补阳还五汤灌胃。假手术组给予蒸馏水灌胃,不睡眠剥夺和微球注射。记录各组大鼠的体质量。实验结束后,处死大鼠,采血分析。酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清中血栓素B 2(TXB 2)和6-酮基-前列环素1α(6-keto-PGF 1α)水平。采用液质联用的代谢组学方法检测血清样品。结果:与假手术组比较,模型组大鼠平均体质量明显降低,TXB 2/6-keto-PGF 1α比值升高(均P<0.05);与模型组比较,补阳还五汤组大鼠平均体质量升高,药物干预可降低TXB 2/6-keto-PGF 1α比值(P<0.05)。代谢组学结果显示,假手术组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),补阳还五汤组部分逆转模型组的变化,指标向假手术组回调的趋势明显。结论:模型大鼠体内的生物代谢途径受到明显干扰,补阳还五汤可以对异常生物代谢途径进行明显的调整,其调整的代谢途径包括:精氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、赖氨酸的生物合成。

基于证候表征生物学的中药复方功效物质基础研究思路与方法

中医临床治疗疾病多以辨证论治,其用药方式多以复方为主,中药复方又多以功效来表述。因此,中药复方的功效既包括了对疾病的治疗,也涵盖了对证候的作用。目前对中药复方功效的研究多围绕治疗疾病的药理作用及发挥作用的药效成分开展研究,而对证候的作用及发挥作用的物质基础研究不足,从而严重影响了中药复方功效的深入研究和科学阐释。其原因主要是由于证候表征的生物学基础缺乏研究,影响了中药复方功效的物质基础研究。基于此,本文首次提出基于“证候表征生物学”的中药复方功效物质基础的研究思路和方法:以中医临床为依据、以病证结合为基础、以功效为导向,在尽可能全面明确中药复方功效的证候表征生物学基础后,整合网络药理学、中药化学、中药药代动力学、生物信息学等多种现代科学技术和方法,解析、确证发挥功效的化学成分及作用机理。该研究思路突出了中医临床应用复方治疗疾病的病证结合、方证相应的用药特点,期望为中医证候及中药复方功效物质基础的研究提供参考。

冠心病痰瘀互结证小型猪血浆代谢组学研究

目的基于液相色谱-质谱联用技术对冠心病痰瘀互结证小型猪血浆除磷脂外的代谢物进行代谢组学分析。方法将小型猪分为对照组和模型组,采用高脂饲料喂养结合冠状动脉内皮损伤法建立冠心病痰瘀互结证小型猪模型。HE和Masson染色观察心肌组织病理变化;血浆样本用96孔SPE板进行除蛋白和去磷脂处理,采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对样本进行检测,偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行数据分析,通过HMDB数据库和二级质谱裂解规律比对,对内源性成分进行定性分析,筛选差异代谢物,通过MetaboAnalyst 5.0结合HMDB、KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路分析。结果HE和Masson染色显示,模型组心肌细胞肥大,部分心肌细胞融合,心肌间质水肿,大量胶原纤维增生;PLS-DA结果显示,模型组和对照组血浆代谢物差异明显,筛选出7a,12a-二羟基-3-氧代-4-胆氨酸、3b,12a-二羟基-5a-胆酸、脱氧胆酸甘氨酸结合物、别石胆酸、十六烷二酸、3-氧代十八烷酸、二十二碳六烯酸、丁烯肉碱、3-羟基-9-十六碳烯酰肉碱、3-羟基十六烷基肉碱、(9E)-10-硝基十八烷-9-烯酰肉碱等26个差异代谢物,涉及肉碱穿梭代谢、花生四烯酸代谢、胆汁酸生物合成、胆碱代谢、丙酮酸代谢等途径。结论内源性非磷脂类成分如胆酸类、脂肪酸类、氨基酸类、酰基肉碱类及其生物代谢途径参与冠心病痰瘀互结证发病过程。本研究可为了解冠心病痰瘀互结证病程进展提供实验依据。

缺血性心脑血管病瘀毒互结证诊断标准的研究

目的:基于文献系统分析和德尔菲法,建立缺血性心脑血管病瘀毒互结证诊断标准。方法:系统分析古今文献,拟定瘀毒互结证德尔菲法专家咨询问卷,邀请全国120名中医、中西医结合心脑血管病专家进行咨询,之后对问卷评分进行统计分析,以肯德尔和谐系数评价专家意见协调程度,以克朗巴赫系数评价问卷信度,以各条目得分均值、变异系数、满分比的中位数为界值筛选主要条目。结果:缺血性心脑血管病瘀毒互结证德尔菲法专家咨询问卷肯德尔和谐系数为0.204,克朗巴赫系数为0.917,表明专家意见协调程度较高、问卷信度良好。以重要性均值≥4.00分、变异系数≤0.21、满分比≥0.30为界值筛选主要条目,经专家讨论优化,形成了缺血性心脑血管病瘀毒互结证诊断标准(草案)。该标准包含必要指标、主要宏观指标、次要宏观指标和实验室指标。结论:缺血性心脑血管病瘀毒互结证诊断标准(草案)既体现了传统中医宏观辨证特点,又纳入了现代理化指标,可初步指导缺血性心脑血管病的病证结合辨证诊断。

同时测定大鼠血浆中阿托伐他汀及其活性和毒性代谢产物的方法建立与应用

目的 建立同时测定大鼠血浆中阿托伐他汀(ATV)及其活性代谢产物2-羟基阿托伐他汀酸(2-HAT)、4-羟基阿托伐他汀酸(4-HAT)和毒性代谢产物阿托伐他汀内酯(ATL)的分析方法并应用于药代动力学研究。方法 采用液相色谱-串联质谱(LCMS/MS)法进行分析。采用一步沉淀法对血浆样品进行处理(血浆样品经酸化调节pH值防止构型转化),采用梯度洗脱分析样品,分析时间为5 min;采用电喷雾离子源,以多反应监测模式进行正离子检测,ATV及其代谢产物2-HAT、4-HAT、ATL及内标匹伐他汀的定量离子对的质荷比(m/z)分别为559.3→440.2、575.2→440.3、575.0→440.2、540.9→448.2和422.2→290.0。对分析方法进行全面的方法学考察后测定ATV及其代谢产物2-HAT、4-HAT、ATL的浓度,并采用WinNonlin 6.1的非房室模型计算ATV及其代谢产物的药代动力学参数。结果 方法学考察结果表明,空白血浆的内源性物质不干扰待测成分的测定,标准曲线线性关系良好,ATV、2-HAT、4-HAT和ATL的定量下限分别为0.5、0.5、0.25、0.063 nmol/L。精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性考察均符合生物分析要求。药代动力学分析表明,大鼠灌胃给药后,ATV迅速代谢,主要以ATV和2-HAT的形式暴露于血液循环,内酯型代谢物浓度最低。结论 建立了针对ATV及其活性和毒性代谢产物的准确、快速、灵敏的血药浓度分析方法,运用该方法可全面解析阿托伐他汀钙在大鼠体内的药代动力学特征。

基于代谢组学技术研究不同剂量肾上腺素血瘀证模型的作用机制

目的:运用代谢组学的方法,探讨不同剂量肾上腺素构建大鼠慢性血瘀证模型的作用机制及其关键代谢物。方法:连续皮下注射不同剂量肾上腺素构建慢性血瘀模型,测定大鼠血液流变学、凝血四项等指标进行模型判断,通过反相液相色谱-串联质谱法(RPLC-MS)与亲水作用液相色谱法-质谱联用(HILIC-MS)技术进行检测,采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)研究给药前后模型内源性代谢物变化。结果:与正常对照组比较,高中低剂量肾上腺素组大鼠全血黏度在不同切变率下均显著升高,凝血四项检测中凝血酶原时间和纤维蛋白原含量显著升高,体质量显著性下降,代谢组实验结果显示正常组与高中剂量肾上腺素组之间区分明显,其分离趋势与给药剂量密切相关,在RPLC-MS模式下发现了葡萄糖、乙酰辅酶A、二十碳五烯酸等代谢物,同时在HILIC-MS模式下发现了牛磺酸、油酸等代谢物,2种检测模式下共发现了与气滞血瘀模型发病机制及演化过程相关的28个潜在生物标志物。结论:一定剂量的肾上腺素会导致慢性血瘀证的发生,随着给药剂量的增加,其造模程度也随着变化。根据机体内与给药剂量呈一定相关性的代谢变化来看,慢性血瘀证的作用机制及其演化过程可能与葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、胆酸代谢、肉碱代谢、酪氨酸及色氨酸代谢等代谢相关。

基于LC-TOF-MS与HILIC和RPLC联用的自发性高血压大鼠血浆代谢组学研究

目的利用液质联用系统(LC-TOF-MS)对自发性高血压大鼠(SHR)实验组和京都种Wistar(WKY,Wistar Kyoto)大鼠对照组的血浆进行分析,利用代谢组学方法探寻SHR的特征性生物标志物及代谢途径。方法收集SHR和WKY大鼠(各12只)的血浆样本,利用反相色谱(RPLC)和亲水相互作用色谱(HILIC)分离血浆中的内源性代谢物,利用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)法进行数据分析。结果在HILIC和RPLC模式下SHR实验组和WKY大鼠对照组之间观察到了良好的分离趋势。鉴定出了包括组氨酸、脯氨酸、尿酸、焦谷氨酸、乙酰肉碱、棕榈酰肉碱、二氢鞘氨醇、3-脱氢鞘氨醇等17个潜在的SHR生物标志物,主要受干扰的代谢途径是氨基酸代谢、肉碱穿梭系统和鞘脂代谢。结论受到影响的生物标志物和代谢途径可为理解高血压的代谢机制提供依据。

延胡索甲素和延胡索乙素的电喷雾质谱研究

目的:对延胡索甲素和延胡索乙素在电喷雾质谱下的裂解途径进行研究。方法:采用高效液相-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MSn)对其样品进行测定。结果:在正离子模式下,延胡索甲素和延胡索乙素围绕碳氮键进行开环裂解,碎裂成苯二亚甲基和四氢异喹啉两部分,形成其鉴定的主要碎片离子。结论:本实验为该类化合物的分析鉴定提供有效的质谱方法。

温胆汤治疗高脂血症金黄地鼠的肝脏代谢组学研究

目的:应用代谢组学方法研究温胆汤对高脂血症金黄地鼠治疗作用的生物学机理。方法:选取34只金黄地鼠随机分为正常组、模型组各11只,温胆汤组12只,采用血脂4项血清生化指标评价高脂血症模型以及温胆汤的干预作用,应用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)进行各组大鼠肝组织内源性代谢物分析,采用偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis PLS-DA)对多变量数据进行分析。结果:与模型组比较,温胆汤组总胆固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平明显降低(P<0.05),通过多元数据分析显示模型组与正常组区分明显,温胆汤给药组有明显向正常组回调的趋势,其中甲硫氨酸、磷脂酰胆碱、腺苷、尿刊酸等20余种成分受到了温胆汤的调节。结论:温胆汤可以调节高血脂金黄地鼠的体内异常代谢途径,提示其治疗作用可能通过对磷脂酰胆碱代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢等生物途径的调节实现。

服务器负载的小波-神经网络-ARMA预测

为提高服务器负载预测的精度,提出一种新的基于小波的预测方法。该方法首先对具有非平稳特征的服务器负载序列进行小波分解与重构,得到一个低频信号和多个不同尺度的高频信号;对具有近似平稳特征的低频信号建立ARMA预测模型;对变化较多的各高频信号分别建立神经网络预测模型;然后分别对各信号进行一步预测并组合预测结果,获得原始负载的最终预测。实验表明:该方法能够有效预测非平稳的服务器负载序列,预测精度明显高于传统预测方法。

基于液质联用技术对早期高脂血症金黄地鼠肝脏鞘脂的靶向代谢组学研究

目的对高脂血症金黄地鼠肝匀浆中鞘脂进行相对定量的靶向代谢组学研究。方法18只SPF级叙利亚金黄地鼠随机分为正常对照组和高脂血症模型组,饲喂6周后进行血液生化检测,取肝脏进行HE染色,观察两组动物血液生化指标和组织病理学变化。基于液质联用技术,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA)进行模式识别,对鞘脂种类进行相对定量分析。结果高脂血症模型组TG、TC、LDL-C、HDL-C水平明显高于正常对照组,均具有统计学差异。肝组织结构紊乱,肝细胞大片气球样变性,灶性小泡性脂肪变,肝细胞肥大致肝窦不明显,枯否细胞增生,肝小叶内可见炎细胞聚集灶,汇管区轻度炎细胞浸润及纤维组织增生。21种鞘脂,包括鞘磷脂(sphingomyelin,SM)、神经酰胺(ceramide,Cer)和葡糖基神经酰胺(glucosyl-ceramide,Glc-cer)在高脂血症仓鼠肝脏出现异常改变。其中,9种Cer上调,4种Glc-cer下调,8种SM中有3种上调,其余5种下调。结论早期高脂血症金黄地鼠的围绕神经酰胺的鞘脂的代谢途径被破坏,可能触模型组的胰岛素抵抗和炎症反应,导致肝脏损伤,影响血脂代谢。基于LC-MS的鞘脂途径的靶向代谢组学研究为了解高脂血症的生物学机理提供了更多有用的信息。

基于液质联用技术的高脂血症金黄地鼠肝脏非靶标代谢组学研究

采用液相色谱-飞行时间质谱联用技术(LC-TOF MS)对高脂血症金黄地鼠的肝匀浆液进行代谢谱分析,并利用模式识别挖掘潜在生物标志物以探索发病机制。采用反相色谱(RPLC)和亲水作用色谱(HILIC)两种模式分离肝匀浆液中的内源性代谢产物。采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)进行数据分析,结合标准品与数据库比对、二级质谱裂解规律对内源性成分进行定性分析。结果显示,模型组和对照组在RPLC和HILIC两种分离模式下均有良好的区分。与对照组相比,在高脂血症组的金黄地鼠肝脏中鉴定出16种差异代谢物,其涉及的主要代谢途径为嘌呤代谢、磷脂酰胆碱代谢、鞘脂代谢和赖氨酸代谢等。这些异常的内源性成分及其生物代谢途径可为了解高脂血症金黄地鼠肝脏发病机制提供依据。

基于支持向量机的Web用户行为异常检测方法

支持向量机作为一种新的机器学习方法,由于其建立在结构风险最小化准则之上,从而使支持向量分类器具有较好的泛化能力。针对应用层用户行为异常检测存在的难点,本文提出了基于无监督支持向量机的应用层用户行为异常检测的方法。实验结果表明,基于超平面和超球面的One-class SVM算法对应用层用户异常行为具有较高的检测率。

高效液相色谱法同时测定藿香正气水中甘草酸、欧前胡素、异欧前胡素、厚朴酚、和厚朴酚的含量

目的:建立高效液相色谱法测定藿香正气水中甘草酸、欧前胡素、异欧前胡素、厚朴酚、和厚朴酚的含量。方法:采用C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以0.05%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(10 min,40%B;25 min,45%B;30 min,50%B;60 min,55%B),流速1.0 mL·min^(-1),检测波长254 nm。结果:甘草酸、欧前胡素、异欧前胡素、厚朴酚、和厚朴酚进样量分别在0.094～0.470,0.041～0.205,0.018～0.090,0.235～1.175,0.311～1.555μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r≥0.9998);平均同收率(n=6)分别为98.3%,99.6%,98.6%,98.0%,99.6%。结论:方法准确、灵敏,专属性强,为藿香正气水提供了多指标含量测定的质量控制方法。

中药复方功效物质基础的研究思路与方法

中药复方的功效代表了复方的整体效应,该效应是中药复方特定化学成分在特定病理条件下对机体发生作用进行调整和整合后的生物效应表达,而这些化学成分就是中药复方功效的物质基础。受多种条件限制,开展中药复方功效物质基础研究的较少,多是药效物质基础的研究,这就造成与中医药理论的脱节,很难对中药复方的功能主治进行科学阐释。在中医药理论和临床实践的指导下,本文提出了中药复方功效物质基础的研究思路与方法进,力争通过多学科、多技术的有机结合,构建中药复方功效物质基础的研究技术体系,进而阐释中药复方功效的产生的化学成分,为中药复方功效物质基础的研究提供借鉴和参考。

益气活血方及其拆方对气虚血瘀型脑梗大鼠影响的比较研究

目的:探讨益气活血方、方中益气药和活血药对气虚血瘀模型大鼠气血的影响。方法:采用荧光微球致多发性脑梗复合睡眠剥夺法制备气虚血瘀型脑梗的病证结合模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、益气活血方组(3.49 g·kg^(-1))、益气药组(1.08 g·kg^(-1))、活血药组(2.408 g·kg^(-1)),脑梗术后复合睡眠剥夺4周,期间每日给药1次。给药4周后测定各组大鼠的负重力竭游泳时间和脉搏幅度,取血进行脑组织血液相关指标及病理切片分析。结果:相较假手术组,模型组动物负重力竭游泳时间明显缩短,脉搏幅度也明显下降(P<0.01);模型组在各切变率下的全血黏度和血浆黏度相比假手术组均显著升高(P<0.01),血清中ET-1、Ang-Ⅱ、IL-6、IL-1β和MDA水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,益气活血方组能延长负重游泳时间,提高脉搏幅度(P<0.05);活血药能降低各切变率下的全血黏度,益气药和全方可降低血浆黏度(P<0.05);益气药能降低Ang-Ⅱ值,益气组与活血组对ET-1都有不同程度的降低(P<0.05),全方优于益气药和活血药组(P<0.01);各给药组IL-1β值相比模型组均有显著降低,活血药组IL-6也有明显降低(P<0.01);活血药和全方MDA水平低于模型组(P<0.05,P<0.01)。病理形态学观察表明,模型组海马组织结构异常,见坏死和炎性浸润,益气组见神经元增生,活血组未见坏死区,全方组病理改变最少,且见炎性组织中细胞恢复状态。结论:益气药与活血药存在协同作用,益气以助血行,改善气虚血瘀,同时活血化瘀进而减少炎症因子及氧化产物的堆积,使全方效果既优于益气药也优于活血药。

栀子苷和梓醇的电喷雾质谱裂解机制研究

目的对栀子苷和梓醇在电喷雾质谱下的裂解途径进行探讨。方法采用高效液相-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-Msn)对样品进行系统研究。结果栀子苷和梓醇在正离子模式下有失去完整葡萄糖和葡萄糖残基两种裂解途径,而在负离子模式下只能失去葡萄糖残基。此外,由于取代基的作用栀子苷在正离子模式下的碎片离子较为丰富,而梓醇的碎片离子则在负离子模式下比较多。结论该质谱检测方法可以为这类环烯醚萜化合物的快速鉴定提供参考。

非标记液相色谱-质谱联用蛋白组学并行分析策略研究

在双酶双碎裂条件下,建立了针对非标记液相色谱-质谱联用蛋白质组学的并行分析策略。应用拥有碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD)两种碎裂方式的液相色谱-质谱联用对经胰蛋白酶和V8酶分别酶解的牛血清白蛋白(BSA)、大肠杆菌及复杂血清样品进行检测。与单酶酶解比较,双酶酶解的蛋白总发现率增加了11%,蛋白总覆盖率可增加10%以上;CID/ETD结合模式分别比CID、ETD模式多鉴定出87和263个大肠杆菌蛋白;对于复杂样品的分析,采用双酶双碎裂并行方式,可使人、猪和兔的血清蛋白检出率分别提高21%、20%和10%。采用并行策略提高了非标记蛋白组分析的效率,并且由于并行方式的互补性,为数据提供了交叉验证,使结果更为可靠。