菘蓝4-香豆酸:辅酶A连接酶全基因家族的鉴定及表达分析

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是植物中类黄酮、可溶性酚酯、木脂素和木质素等苯丙烷类化合物上游途径的关键酶。该研究基于菘蓝基因组数据库,以拟南芥Arabidopsis thaliana的13个4CL家族成员为参考序列,获取菘蓝4CL基因家族的候选成员,并进行生物信息学分析、4CL基因表达模式及类黄酮代谢成分积累模式等研究。结果共获得13条菘蓝4CL基因家族成员,分别命名为Ii4CL1~Ii4CL13,分别定位到1、2、3、4、6号染色体上。基因结构与保守结构域分析发现菘蓝4CL基因家族成员的内含子数目为1~12,蛋白结构域具有高度保守性。顺式作用元件分析表明在菘蓝4CL基因家族成员启动子序列中存在多个响应元件,其中茉莉酸反应元件数量最多。共线性分析表明菘蓝4CL基因家族成员与同科植物拟南芥之间存在更近的亲缘关系。qPCR结果显示,菘蓝4CL基因家族表达分析发现10个4CL基因在菘蓝的地上部分相对表达量更高。对菘蓝不同部位类黄酮化合物的含量进行检测,发现菘蓝的类黄酮主要积累在地上部分。该研究为深入探索菘蓝4CL基因家族成员参与菘蓝类黄酮生物合成的分子机制奠定了基础。

催化根皮素生成三叶苷的来源于穿心莲的糖基转移酶UGT74L2及其酶学研究

根皮素-4’-O糖基转移酶(P4’-OGT)是三叶苷生物合成途径中最后一步关键酶,可在体外催化根皮素生成三叶苷,但目前仅有少数P4’-OGT被鉴定。本研究利用已报道的苹果中P4’-OGT(MdPh-4’-OGT)序列对穿心莲转录组进行筛选,获得两条同源基因UGT74L2和UGT74L3。系统发育树分析表明,UGT74L2和UGT74L3与其他物种中已鉴定功能的UGT74家族聚为一类。体外酶促反应显示,UGT74L2可特异性催化根皮素生成三叶苷,而UGT74L3无产物产生。通过Ni-NTA亲和色谱纯化获得可溶性UGT74L2重组蛋白,以根皮素为底物进行酶促动力学研究。研究结果表明,UGT74L2酶促反应最适温度为40℃,最适pH值为8.0(Tris-HCl体系)。Ca^(2+)、Mn^(2+)、Co^(2+)对UGT74L2的活性有一定的抑制作用,而Mg^(2+)可提高UGT74L2的活性,其他金属离子对UGT74L2活性无明显影响。酶促动力学参数测定结果显示,K_(m)值为29.84μmol·L^(-1),kcat值为0.02 s^(-1),k_(cat)·K_(m)^(-1)值为572.6 mol^(-1)·s_(-1)。同源建模、分子对接结合突变实验结果显示,底物结合口袋中的多个氨基酸与其催化活性密切相关。本研究从穿心莲中鉴定了一条新的P4’-OGT,可为活性天然产物三叶苷的生物合成提供糖基化元件,也可为其他植物糖基转移酶的功能挖掘提供参考。

植物天然产物途径创建

植物天然产物是创新药物的重要源泉,主要从植物中分离提取获得,但由于含量低、结构类似物多、生产成本高等因素限制了对植物天然产物的深入开发利用。植物天然产物途径创建通过生物合成途径解析、代谢途径重构和优化,能够实现植物天然产物的异源合成,为其提供高效稳定的绿色获取方式。随着国际上具有影响力的研究工作的报道,基于我国丰富的药用植物资源和深厚的中医药研究经验,植物天然产物尤其是具有明确药理活性的中药活性成分的生物合成途径解析在国内广受关注,并取得了丰硕研究成果。本文综述了植物天然产物生物合成及其合成生物学生产的研究进展和思路,对近年新方法新技术的应用进行总结和讨论,为植物天然产物途径创建提供参考。

菘蓝木脂素糖基转移酶体外催化根皮素的酶学研究

体外酶促反应发现前期克隆的菘蓝木脂素糖基转移酶UGT236(属于UGT71B家族)能高效催化根皮素生成根皮苷。UGT236与苹果中的P2′GT同源性较高,同属UGT71家族。该研究将重组质粒pET-28a-MBP-UGT236转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,并通过纯化获得较高纯度的UGT236蛋白,以根皮素为底物,研究其酶学性质。结果显示,UGT236最适反应温度为40℃,最适反应pH为8(Na_(2)HPO_(4)-NaH_(2)PO_(4)体系)。金属离子影响实验表明,Ni^(2+)、Al^(3+)对UGT236有一定抑制作用,Fe^(2+)、Co^(2+)、Mn^(2+)3种离子均能提高UGT236的活性,而Mg^(2+)、Ca^(2+)、Li^(+)、Na^(+)、K^(+)对UGT236的活性没有影响。酶动力参数实验测得根皮素的K_(m)为61.03μmol·L^(-1),K_(cat)为0.01 s^(-1),K_(cat)/K_(m)为157.11 mol^(-1)·s^(-1)·L,UDPG的K_(m)为183.6μmol·L^(-1),K_(cat)为0.01 s^(-1),K_(cat)/K_(m)为51.91 mol^(-1)·s^(-1)·L。通过同源建模、分子对接筛选出部分可能的活性位点,对其进行突变及活性检测鉴定了3个关键的活性位点Glu391、His15、Thr141,而位点Phe146则和产物的多样性有关。该研究发现菘蓝中木脂素类糖基转移酶UGT236能催化根皮素生成根皮苷,对其酶学性质进行了探究,通过结构预测、分子对接和突变验证发现了几个关键的氨基酸残基,为根皮素糖苷产物的专一性和多样性催化提供了一定依据,可为后续通过改造获得高效和专一性催化的人工糖基转移酶元件提供参考。

菘蓝查尔酮异构酶基因的克隆与体外酶活鉴定

查尔酮异构酶是高等植物黄酮类化合物生物合成中的关键限速酶,决定了植物体内黄酮类化合物的产生。该研究从菘蓝的不同部位中提取RNA,反转录为cDNA,并设计带有酶切位点的特异性引物,克隆得到1个菘蓝查尔酮异构酶基因,命名为IiCHI。该基因全长756 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码251个氨基酸。通过同源比对显示IiCHI与拟南芥Arabidopsis thaliana的CHI蛋白亲缘关系较近,并且具有查尔酮异构酶典型的活性位点,系统发育树分析显示IiCHI归属于Ⅰ型CHI。构建原核表达载体pET28a-IiCHI并进行诱导表达,纯化后获得IiCHI的重组蛋白。体外酶活性检测实验显示IiCHI重组蛋白可以把柚皮素查尔酮催化生成柚皮素,而不能把异甘草素催化生成甘草素。实时荧光定量PCR结果显示菘蓝中IiCHI在地上部分的表达量明显高于地下部分,其中地上部分在花中表达量最高,叶与茎次之,在地下部分的须根、根的皮部与木质部几乎不表达。该研究为进一步探讨菘蓝中查尔酮异构酶的功能及其在黄酮类化合物的生物合成研究中提供了参考。

菘蓝木脂素类糖基转移酶基因IiUGT349克隆及功能表征

对菘蓝转录组数据进行系统挖掘,获得110条假定糖基转移酶。利用原核表达和体外酶促体系,获得了1条新的木脂素糖基转移酶基因,暂命名为IiUGT349。活性检测发现IiUGT349能催化落叶松树脂醇生成落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷和落叶松树脂醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷。生物信息学分析表明,IiUGT349的开放阅读框(ORF)为1 401个碱基,编码467个氨基酸,编码的蛋白质理论等电点为5.96,相对分子质量为52.77 kDa。系统发育树分析显示IiUGT349和已报道的木脂素糖基转移酶同源性较低,归属于UGT90家族,可能代表了一类新的木脂素糖基转移酶。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示IiUGT349在根、茎、嫩叶和叶中均表达,其中在茎中表达量最高。体外酶促反应显示IiUGT349对落叶松树脂醇最佳反应时间为12 h,最佳反应温度为45℃。亚细胞定位发现IiUGT349定位于植物细胞质和细胞核中。该研究克隆得到了1条新的属于UGT90家族的木脂素糖基转移酶IiUGT349,为深入研究此关键酶基因功能和菘蓝木脂素糖苷生物合成途径奠定了基础,对木脂素糖苷活性成分的合成生物学研究有重要意义。