氧化石墨烯强化铜绿假单胞菌降解污染土壤多环芳烃的效果及其机制研究

微生物修复技术具有经济绿色、环境友好等特征,已成为多环芳烃(PAHs)污染土壤的主要修复手段之一。然而,针对经历长期老化的污染场地土壤,微生物修复效率偏低,生物强化技术亟待进一步提高。以PAHs高效降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PAE)为对象,研究了新型碳质纳米材料氧化石墨烯(GO)对PAE生长和PAHs降解的影响,探讨了GO强化PAE降解土壤PAHs的效果及其机制。结果显示:(1)50~100 mg/L GO可以显著促进PAE的生长和胞外聚合物(EPS)的分泌。(2)PAE及GO(100 mg/kg)的添加显著促进了老化土壤中PAHs的降解。(3)GO添加前期,土著微生物群落丰度下降,PAE丰度显著增加;处理后期,土壤细菌群落丰度恢复至对照组水平。适宜浓度GO的添加可以影响土壤微生物的多样性和丰度,促进PAHs的降解,然而,修复后期GO的影响力下降,土壤微生物群落呈现出“扰动—恢复”模式。研究结果有助于深入理解GO对环境微生物的效应,为PAHs污染土壤的微生物修复提供新思路。

改进MSAP-PCR技术应用于Cd胁迫下拟南芥DNA甲基化分析

全基因组DNA甲基化分析是植物胁迫表观遗传损伤研究的主要方向之一,目前可用手段虽多,然而多数较繁琐,不利于表观遗传损伤的快速诊断。为此应用MSAP-PCR法研究Cd胁迫下拟南芥基因组甲基化变化,并通过优化实验条件、筛选引物(共5条,包括通用引物MLG2和本实验室设计引物AP-1、AP-2、AP-3、AP-4)以及检验多态性和敏感性,综合评估该方法在植物甲基化研究中的应用前景。研究结果发现:该方法模板量选择在150~250 ng并使用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳(含50%尿素)分辨PCR产物多态性最佳;该方法对镉敏感性高,在0.2 mg·L-1Cd2+水平就可检测约30个位点的甲基化多态性;引物AP-4对Cp G位点甲基化变化最敏感,而AP-3对CHG位点甲基化变化敏感性最高。该方法操作简便、成本低廉、结果准确且敏感性高,可作为植物全基因组甲基化研究的理想方法,以及植物抗逆研究和环境污染早期诊断的生物胁迫标记物。

Cd胁迫诱导拟南芥幼苗DNA损伤分析

以拟南芥为供试植物,通过基于随机引物扩增多态性(RAPD)法的DNA损伤分析,酶联免疫吸附(ELISA)法的DNA甲基化分析以及Real-time PCR的DNA损伤修复与细胞周期相关基因的表达分析,研究了Cd(0、0.125、0.25、1.0、2.5 mg·L^(-1))胁迫5 d的拟南芥幼苗DNA损伤、DNA损伤修复系统以及细胞周期对胁迫的响应。结果显示,随Cd浓度的增加DNA损伤加剧,全基因组甲基化水平较对照组显著增加(P<0.01或P<0.05),细胞周期调控基因PCNA1、PCNA2,错配修复(MMR)基因MLH1、MSH_2、MSH6,非同源末端连接(NHEJ)标志基因KU70、MRE11、GR1,同源重组(HR)标志基因RAD51、BRCA1的表达均与Cd胁迫浓度呈明显的倒U型剂量效应关系,DNA修复系统对Cd胁迫的敏感性依次为MMR>HR>NHEJ。该结果表明:轻度Cd胁迫主要引起DNA错配损伤,并且该损伤易修复;随着Cd胁迫的增强,会引起DNA断裂与染色体损伤,损伤较难修复。另外,对Cd胁迫响应最敏感的MSH6、MLH1基因可作为表征Cd胁迫对于拟南芥遗传毒性效应的有效生物标记物。

氨氮对斑马鱼3种酶活性和基因表达的影响

目的:从酶活性测定和酶基因表达两方面探讨氨氮对斑马鱼的毒性效应,为快速准确评价氨氮水环境质量提供理论依据。方法:以斑马鱼为受试生物,研究氨氮对其毒性效应,分别在第3d和第14d测定斑马鱼肝脏组织SOD和AChE酶活性变化,进一步运用半定量RT-PCR测定AChE、SOD以及CYP450基因相对转录量。结论:氨氮对斑马鱼96h-LC50为86.36mg·L-1;SOD和AChE酶活性在暴露3d时变化均不显著,暴露14d时前者表现为低浓度促进高浓度抑制的趋势,后者始终处于抑制状态,且具明显的剂量-效应关系;与酶活性测定相比,相应基因(SOD、CYP450和AChE)在转录水平上的变化出现更早,更灵敏,用于氨氮污染检测更具有时效性。

镉诱导拟南芥幼苗DNA损伤

采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)标记技术,并结合幼苗的形态和生理指标,研究镉(Cd)胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗基因组DNA损伤的影响。结果表明,不同浓度(0.25～5.0mg·L-1)Cd处理24d后,拟南芥幼苗根生长受到显著抑制,地上部分可溶性蛋白质含量呈先升高后降低的趋势,但对拟南芥幼苗叶片数、鲜重及叶绿素含量影响不大。选用12条寡核苷酸引物对拟南芥幼苗地上部分与根系基因组DNA进行PCR(polymerase chain reaction)扩增,发现处理组与对照组RAPD图谱之间存在明显差异,且与镉浓度之间存在剂量-效应关系。基因组模板的稳定性(genomic template stability,GTS)随着Cd浓度的增加而降低。3个处理组幼苗地上部分GTS分别为91%、89%和80%;相应根部GTS分别为71%、67%和60%。研究表明,利用RAPD技术获得的拟南芥DNA多态性变化可作为检测镉遗传毒性效应的生物标记物。比照其他几个指标,拟南芥幼苗根部RAPD谱带变化的敏感性更为优异,具有较好的应用前景。

镉胁迫对拟南芥幼苗基因组DNA多态性的影响

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,检测了镉(Cd)胁迫对拟南芥幼苗叶片DNA多态性的影响,并结合其形态和生理指标,选取Cd污染敏感的生物标记物。结果表明:0.125～3.0mg·L-1Cd处理21d后,拟南芥幼苗叶片的可溶性蛋白质含量随Cd浓度的增加呈倒U字型曲线变化,但其鲜重和叶绿素含量变化均不明显;12条寡核苷酸引物中,有5条引物扩增出稳定、特异的PCR产物;拟南芥幼苗叶片基因组的RAPD图谱中,对照组RAPD图谱中分辨出44条清晰的条带;Cd胁迫使拟南芥幼苗叶片基因组的RAPD图谱发生了改变,包括条带的增加、缺失和条带荧光强度的改变,且与Cd剂量相关。实验证明,Cd影响基因组模板的稳定性,即DNA多态性对Cd污染敏感,可以作为检测Cd污染及其相关生物学效应的潜在生物标记物。

铜胁迫对拟南芥幼苗生长和基因组DNA甲基化的影响

通过Murashige and Skoog（M＆S）培养实验,利用甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术研究Cu2＋胁迫对拟南芥幼苗基因组DNA甲基化水平与甲基化模式的变化,同时比较其与幼苗鲜重、根系生长对Cu2＋胁迫的敏感性。结果表明：0、0.25、1.0 mg獉L-1Cu2＋处理15 d后,幼苗根长及鲜重变化差异不显著,而幼苗基因组MSAP率随Cu2＋浓度的增加呈先增高后降低的趋势,分别为15.93%、16.28%和15.83%;高浓度Cu2＋胁迫下（3.0 mg獉L-1）,根长显著变短,鲜重显著降低,MSAP率为14.26%;Cu2＋胁迫（0.25~3.0 mg獉L-1）下,拟南芥幼苗基因组超甲基化（M型）位点及去甲基化（D型）位点数均呈显著增加趋势,Msp I酶较Hpa II酶对胁迫反应更敏感。因此,拟南芥幼苗MSAP变化对低浓度Cu2＋胁迫响应敏感,可作为Cu污染的早期诊断和生态风险评价。

水环境因子对镧系元素生物毒性效应的影响

镧系元素(稀土)应用的不断拓展引起了人们对其生物安全性的关注。为探明环境因素对镧系元素生物毒性效应的影响,以斑马鱼(Danio rerio)为受试生物,研究水环境因子(pH、HCO_(3)^(-)、Ca^(2+)-Mg^(2+)、K^(+)和Cl^(-)等)对镧系元素生物毒性和生物蓄积性的影响,分析不同水环境条件下4种代表性镧系元素(La、Ce、Gd和Ho)的毒性大小及其趋势。结果表明:在标准水中,La对斑马鱼成鱼的96 h-LC50为165.6μmol·L^(-1),毒性大小与水中pH、HCO_(3)^(-)和Ca^(2+)-Mg^(2+)浓度显著相关,其斜率分别为0.912、1.135和0.222,而与水中Cl^(-)、Na^(+)、K^(+)和SO_(4)^(2-)的浓度无显著性关系;4种镧系元素均可在测试开始阶段与HCO_(3)^(-)络合形成沉淀颗粒,pH的降低或HCO_(3)^(-)的减少可促进颗粒态镧系元素向可溶态转化,从而增强其生物毒性和生物蓄积性;在pH 5.0和HCO_(3)^(-)0.2 mmol·L^(-1)(排除沉淀影响)条件下,4种镧系元素呈现毒性一致的趋势(对斑马鱼的96 h-LC50为6.11~6.43μmol·L^(-1));可见,在标准水中,4种镧系元素毒性的差异可能是由于单个元素的有效态差异而不是元素的不同毒性所致。因此,在生物毒性机制的差异被揭露之前,镧系元素可视为一组具有毒性相加模式的元素进行生物毒性评估,评估过程应注重pH和碳酸盐的影响。

生物炭与表面活性剂联合强化淋洗去除污染土壤中PAHs的效果及其机制

采用生物炭吸附与表面活性剂淋洗联合修复PAHs污染场地土壤,通过外源添加700℃制备的稻壳生物炭,研究了添加生物炭对非离子型表面活性剂TX-100淋洗PAHs效果的影响;通过老化后的含芘高岭土模拟污染土壤,研究了生物炭吸附与TX-100淋洗联合修复的驱动机制。强化淋洗修复结果显示:TX-100浓度为10 g·L^(-1),淋洗时间为16 h,固液比为1∶10,转速为150 r·min^(-1),对本研究选取的PAHs浓度为94.97 mg·kg^(-1)的污染土壤的淋洗效果最好,解吸率达66.2%;添加1%土壤质量的稻壳生物炭,稳定14 d后,TX-100对PAHs解吸率从对照的66.2%提高到了80.6%(P<0.05),其中四环PAHs的解吸量占比最高(42.1%)。高岭土模拟结果显示:添加1%土壤质量的生物炭14 d后,高岭土中芘含量从50 mg·kg^(-1)降低至27.77 mg·kg^(-1),同时TX-100可以有效洗脱生物炭上吸附的芘,解吸率达80.2%。扫描电镜和光谱学分析显示:生物炭可以吸附TX-100,而被吸附的TX-100又会占据部分生物炭孔道,后者在1600 cm^(-1)处的C=O和C=C吸收振动峰和1103~1025cm^(-1)处的C-O-C吸收振动峰明显减弱,进一步导致PAHs从固相向液相的迁移。因此,在表面活性剂淋洗修复前,添加生物炭可以显著提高土壤PAHs的解吸率。

稀土元素铈对斑马鱼肝脏的遗传毒性

以稀土元素中丰度最大的铈(Ce)为代表污染物,以斑马鱼(Danio rerio)为受试生物,采用RAPD-PCR和MSAP-PCR技术研究Ce对斑马鱼基因组DNA损伤及DNA甲基化的影响。结果表明,不同浓度Ce^(3+)(0、5、10和20μmol·L^(-1))胁迫斑马鱼28天后,Ce^(3+)主要在斑马鱼肝脏中富集(BCF:5.49~9.33),其次为腮(BCF:3.58~4.49)和肌肉(BCF:0.13~0.25);RAPD-PCR分析显示,Ce^(3+)(>10μmol·L^(-1))胁迫能够诱导斑马鱼肝脏DNA的损伤;MSAP-PCR分析显示,Ce^(3+)胁迫引起的斑马鱼肝脏基因组DNA甲基化总变化率分别为8.93%(CK)、9.12%(5μmol·L^(-1))、15.56%(10μmol·L^(-1))和28.83%(20μmol·L^(-1)),其中低浓度胁迫下,斑马鱼肝脏基因组DNA去甲基化(D)型显著增加,高浓度下,甲基化(M)型显著增加,DNA甲基化多态性亦随胁迫浓度的增大而变大;测序分析结果显示,这些特异性甲基化条带与zinc finger protein STZ/ZAT10、ABC transporter 1、cell cycle control phosphatase superfamily protein等基因具有较高的同源性;与RAPD标记相比,DNA甲基化标记对Ce^(3+)的胁迫响应具有高敏感性。研究结果深化了对稀土元素生物学效应的认识。

菲对摇蚊幼虫的急、慢性毒性效应

依照OECD 235和218指导准则,选用溪流摇蚊(Chironomus riparius)幼虫为受试生物,以存活率、羽化时间为评价指标,通过暴露于加标水中(48 h)和加标沉积物中(28 d)两种方式研究菲对摇蚊幼虫的急、慢性毒性。结果表明:对于急性毒性实验,在加标水中菲对摇蚊幼虫的LC50为1.1 mg·L^(-1)(24 h)和337.2μg·L^(-1)(48 h)。对于慢性毒性实验,在加标沉积物中菲对摇蚊幼虫的28 d-LC50为24.9 mg·kg^(-1);孔隙水中菲对摇蚊幼虫的28 dLC50为10.4μg·L^(-1);另外,随沉积物中菲浓度增加,幼虫的平均羽化时间提前,当沉积物中菲浓度达到5 mg·kg^(-1)及以上时,受试幼虫的平均羽化时间比对照组及低浓度组显著提前(P<0.05),在菲浓度为10 mg·kg^(-1)时比对照组提前了3.8 d,而提前时间在大于5mg·kg^(-1)的各浓度处理之间无显著差异(3.7~4.2 d)。

嫁接诱导植物镉富集性状的改变

以野生茄(Solanum torvum,托鲁巴姆)为砧木,茄(Solanum melongena)和番茄(Solanum lycopersicum)为接穗植物,通过田间小区实验,研究了嫁接对重金属Cd在接穗植物地上部分积累的影响,同时探究了元素S对植物Cd积累过程的影响。结果表明:与自根植株相比,对照小区与2 mg·kg-1Cd处理小区内,嫁接茄植株的茎、叶及果实Cd含量分别减少78.0%、86.3%、93.2%和89.1%、89.5%、92.3%;嫁接番茄植株的茎、叶及果实Cd含量分别减少20.6%、15.5%、10%和79.3%、48.3%、4.2%;同时,嫁接植株(茄、番茄)叶片中的总硫(TS)含量显著减少,其变化趋势与Cd积累变化趋势呈正相关关系。研究证明,特异性砧木可以改变嫁接植株重金属Cd富集性状,不同作物对同一砧木的响应存在种间差异,这种改变与嫁接植株S含量变化密切相关。

冻融对生物炭稳定化修复中土壤镉形态的影响

冻融是北方寒冷地区重要的气候变化过程,是影响土壤及稳定化材料性质的重要因素。本研究通过模拟冻融循环过程,考察了冻融对生物炭稳定化修复过程中镉(Cd)形态变化的影响,探讨冻融交替影响Cd形态变化的主要机理。结果表明:在生物炭稳定化修复过程中,冻融交替16次,土壤中弱酸提取态Cd含量提高了16.07%,可还原态Cd含量提高6.67%,可氧化态Cd含量升高15.37%,残渣态含量变化不明显,总体上土壤有效态Cd含量升高,增加了Cd的生态风险。其可能原因有:一方面,冻融交替16次,未加生物炭土壤自身弱酸提取态Cd含量升高11.74%,可还原态Cd含量升高13.53%;土壤毛管孔隙度从41.72%增加到57.63%,土壤p H值略有降低,土壤溶解性有机碳的含量呈现先显著升高15.38%后降低10.17%的趋势,共同促进了土壤-Cd体系中弱酸提取态和可还原态Cd的升高;另一方面,冻融交替过程中,生物炭的孔道管状结构及完整性遭破坏,羟基-OH、烷烃CH、芳香结构等伸缩振动峰减弱且发生偏移,碳酸盐成分减少,导致了生物炭对Cd吸附位点减少,吸附能力降低。

嫁接诱导大豆低镉富集性状及遗传稳定性

通过野外小区实验,从8个大豆品种中筛选出2个低镉富集品种作为砧木,2个高镉富集品种作为接穗植物,研究嫁接当代以及接穗子代镉富集性状的变化,探明嫁接诱导镉富集性状变异的机制及其遗传稳定性。结果表明:大豆的镉富集性状表现出显著的品种间差异,以低镉富集品种(铁丰29和东鲜1号)作砧木,可以使接穗大豆植株(青仁黑1号和中黄38)地上部分镉含量降低50%~70%;高通量测序和qRT-PCR分析显示,嫁接诱导了相关硫代谢基因的差异表达,与自根植株相比,嫁接植株的APX2、PAPRa、SAM1a和ATPs基因表达水平均显著下调,分别达72.53%、67.62%、42.37%和75.78%,APK4表达量则显著上调2.83倍;以阻控效果最好的青仁黑1号-东鲜1号为例,接穗子代遗传了接穗当代的低镉富集性状,对照亲本,子代籽粒镉含量的降低率仍有30%~50%。研究证明:嫁接可以通过调控含硫化合物的合成与代谢,影响作物地上部分的Cd富集性状,且这种性状可以在子代中稳定遗传。