自动化Chelex-100法在接触性检材DNA提取中的应用研究

目的使用Chelex-100方法在核酸载体分离板(96孔)上对接触性生物检材DNA进行载体分离和纯化,并将其与TECAN Freedom EVO150-8自动化工作站进行结合,建立起一种自动化、快速、灵敏、高效的DNA提取方法并探讨其在法医学中的应用价值。方法在核酸载体分离板(96孔)上使用Chelex-100液裂解DNA,通过高速离心实现批量生物检材载体与DNA分离;通过编写EVO150-8自动化工作站应用程序实现批量生物检材的快速提取、PCR构建一体化过程;采用。Identifiler Plus试剂盒进行PCR扩增,扩增产物经3500 xL遗传分析仪电泳,GeneMapperID-X软件分析检测结果。结果在994份生物检材中,成功获得456份检材STR分型,平均检验成功率在45.88%;对92份生物检材DNA提取及PCR构建,仅耗时60 min。结论本研究应用核酸载体分离板(96孔),建立的自动化Chelex-100法快速、高效、灵敏,适用于批量接触性检材的DNA检测。

荧光标记LDR-PCR复合扩增方法对高度降解DNA检材的SNPs分型研究

目的构建一套基于连接酶检测反应(LDR)的荧光标记PCR复合扩增体系,为解决高度降解DNA法医学分析提供新的策略。方法选择8个单核苷酸多态性(SNPs)位点(rs10802248、rs10516197、rs10488372、rs2278945、rs4757318、rs4887255、rs4889002和rs9304473),设计合成各SNPs位点的LDR探针和连接产物PCR引物,通过LDR将连接产物进行PCR扩增,并将扩增产物进行毛细管凝胶电泳,构建复合扩增SNPs分型体系。结果使用荧光标记LDR-PCR复合扩增方法,对不同个体的8个SNPs位点进行分型,分型结果与测序结果完全一致;对于甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)检材高度降解的DNA样品,荧光标记LDR-PCR复合扩增体系能够实现8个SNPs位点的准确分型。结论荧光标记LDR-PCR复合扩增方法能够对8个SNPs位点进行一次性分型,结果准确、可靠,是一种简单、高效并且较为实用的SNPs分型新方法,适用于高度降解检材的检测。

5-HTT基因3个SNP位点遗传多态性与偏执型精神分裂症的相关性

目的探讨5-羟色胺转运体(5-hydroxytryptamine transporter,5-HTT)基因3个SNP位点(rs25533、rs34388196、rs1042173)的群体遗传学信息及其与偏执型精神分裂症的相关性。方法采用PCR-RFLP技术对中国北方汉族群体132例偏执型精神分裂症患者和150例健康无关个体5-HTT基因3个SNP位点遗传多态性进行检测,使用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验,对单倍型频率、群体遗传学参数进行统计学分析。结果 5-HTT基因3个SNP位点组成4种单倍型,其频率在精神分裂症组与对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05),3个SNP位点的DP值分别为0.276、0.502、0.502,PIC值分别为0.151、0.281、0.281,PE值分别为0.014、0.072、0.072。结论 5-HTT基因3个SNP位点及其组成的4种单倍型与偏执型精神分裂症无相关性,而其多态性具有较高的法医学应用价值。

X-STR侧翼序列SNPs在特殊亲缘关系及混合样品鉴定中的意义

目的通过STR侧翼序列单核苷酸多态性(SNPs)的筛选,构建解决特殊亲缘关系及二人混合样品的个人识别鉴定的新方法。方法筛选STR侧翼序列中的SNPs,对包含SNPs的片段进行扩增并测序获得其分型结果,设计序列特异性引物进行扩增并测序。结果获得该STR位点不同来源个体的分型结果。结论成功构建基于STR侧翼序列SNPs的二人混合样品的检测方法,并可应用于特殊的亲缘关系鉴定中。

NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用研究

目的探讨NASS唾液卡在唾液核酸采集中的应用效果。方法对NASS唾液卡与FTA唾液卡进行抗菌能力测试和防霉能力测试;使用两种唾液卡分别采集21份人员口腔拭子,通过Identifiler Plus试剂盒进行PCR直接扩增,对STR基因座峰面积进行配对t检验;使用两种唾液卡各采集1000份人员口腔拭子,通过Identifiler Plus试剂盒复合扩增检测STR分型。结果抗菌能力测试中NASS唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于99.9%,FTA唾液卡对大肠杆菌的抑菌率大于94.4%,对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌两种唾液卡抑菌率均大于99.9%;防霉能力测试中,21天时NASS唾液卡的长霉级别为2级,FTA唾液卡为3级,其他条件下二者无差别;NASS唾液卡和FTA唾液卡对PCR均存在一定程度的抑制,NASS唾液卡在D7S820、D13S317、TPOX、FGA基因座峰面积大于FTA唾液卡(0.01<P<0.05),在CSF1PO、D2S1338、D18S51基因座峰面积显著大于FTA唾液卡(P<0.01),其余基因座无统计学意义(P>0.05);批量检测中,NASS唾液卡检出率为98.3%,FTA唾液卡检出率为97.9%。结论 NASS唾液卡在抗菌、防霉能力以及对PCR扩增的抑制程度方面优于FTA唾液卡,适合在唾液核酸采集中应用。

中国北方汉族群体多巴胺受体D5基因4个SNP遗传多态性

目的调查多巴胺受体D5(dopamine receptor D5,DRD5)基因rs77434921、rs2076907、rs6283、rs1800762 4个SNP位点在中国北方汉族群体中的遗传多态性分布。方法采用PCR测序方法对中国北方汉族206例个体的4个SNP位点进行检测,应用Haploview v4.1软件进行统计分析。结果在中国北方汉族群体中rs77434921、rs2076907、rs6283、rs1800762位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。个体识别能力(DP)分别为0.145、0.532、0.602、0.159,非父排除率(PE)分别为0.004、0.079、0.196、0.007。4个SNP处于连锁不平衡状态,可以组成5种单倍型。结论中国北方汉族人群DRD5基因rs2076907与rs6283位点多态性分布较好,在法医学个体识别与亲子鉴定中具有一定的应用价值。

D1S1656基因座三带型等位基因分析1例

1材料与方法 1.1样本来源 本研究样本为实验室某DNA建库人员口腔拭子以及其父母双亲的口腔拭子。 1.2 DNA检验 1.2.1 STR基因座检测 使用打孔器在建库人员口腔拭子FTA卡（Whatman公司,英国）

江苏汉族人群D1S1656、SE33和D22S1045基因座遗传多态性

本文对中国江苏地区汉族206名健康无关个体进行D1S1656、SE33和D22S1045基因座遗传多态性进行调查。采用Global FilerTM试剂盒对样本DNA进行直接扩增及检测。结果在3个STR基因座共检出50个等位基因和189种基因型,其分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。本文3个STR基因座在所调查的江苏汉族人群中具有较好识别能力,可在相关鉴定中选择应用。

光质对工程聚球藻7002生长及psbA启动子的调控

工程聚球藻的psbA基因及其所用载体的启动子Ppsb A均受光质调控,利用该机制可通过光质调控提高聚球藻的光合效率及其外源基因表达率。以转vp28基因聚球藻7002为实验材料,通过优化光强、温度及pH,解除光限制因素并提高光能利用率。通过改变白光、红光及蓝光的比例,调控光质组成及单色光的光强,检测细胞生长、外源基因的表达及psb A基因的转录。研究结果表明:高比例蓝光下,vp28基因的表达率达到2.4%,是纯白光下的3倍,重组蛋白VP28的积累量提高至2倍。高比例红光抑制了psb AII、psb AIII基因及外源基因的表达,但促使生物量在3 d内突破1.5 g/L。本研究为蓝藻的生物制药和工程蓝藻代谢产物的产业化提供了理论基础。

TES缓冲液在陈旧性血斑金标抗人Hb试剂条试验中的应用

目的分析评价TES缓冲液在陈旧性血斑金标抗人Hb试剂条试验中的应用效果。方法对31份10年以上的陈旧性血斑进行联苯胺试验;分别使用蒸馏水和TES缓冲液震荡浸泡检材,于0h、6h、12h、24h进行金标抗人Hb试剂条试验。结果 31份陈旧性血斑联苯胺试验呈不同程度阳性;金标抗人Hb试剂条试验,TES缓冲液组有9份检材检测为阳性,6h后14份检材出现阳性结果,而蒸馏水组仅有1份检材浸泡6h后检测为阳性。结论对于10年以上的陈旧性血斑,使用TES缓冲液进行金标抗人Hb试剂条试验,并适当延长浸泡时间能显著提高种属鉴定检出率。

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰（英文）

【目的】DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。【方法】首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spf BCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了Spf B蛋白与DNA结合序列。【结果】spf B基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spf B基因的回补能够恢复该表型,证明spf B基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在?spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spf BCDE的启动子区域5′-TGTTTGT-3′相结合。【结论】SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spf BCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。