基于血管紧张素转换酶2受体表达的SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法的建立及验证

目的建立基于血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)受体表达的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)假病毒中和活性检测方法,并进行验证。方法采用流式细胞术和qPCR法分别检测Huh-7及HEK293T-hACE2细胞中ACE2受体蛋白表达和ACE2受体基因mRNA转录水平。选择ACE2受体蛋白表达及mRNA转录水平较高的细胞建立SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法,并优化病毒滴度、细胞浓度及抗体浓度。验证方法的准确性、线性范围、精密性及专属性。评价建立方法对假病毒拉姆达及德尔塔变异株的适用性。结果HEK293T-hACE2细胞中ACE2受体蛋白表达和ACE2受体基因mRNA转录水平远高于Huh-7细胞,因此采用HEK293T-h ACE2细胞建立SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法。最佳病毒滴度为2.6×104TCID50/mL,细胞浓度为4×1054个/mL,抗体浓度为100 nmol/L。150%、130%、100%、70%、50%5个相对活性浓度的SARS-CoV-2抗体参考品(简称参考品)的回收率在80%~120%范围内;参考品在50%~150%相对活性浓度范围内实际检测值与理论值呈良好线性关系,线性方程为:Y=1.061 X-7.72,R=0.9472;精密性验证CV均<10%;参考品的相对活性浓度与抑制率可拟合成四参数拟合曲线,重组抗RANKL人源化全单克隆抗体及制剂缓冲液均未显示曲线。假病毒拉姆达和德尔塔变异株的假病毒中和活性检测结果均可获得拟合曲线。结论建立的基于ACE2受体表达的SARS-CoV-2假病毒中和活性检测方法具有良好的准确度、精密性、线性及专属性,有望应用于SARS-CoV-2抗体类药物早期筛选及研发过程中质量的控制。

基于ELISA与NMR方法的降钙素基因相关肽抗体的抗原表位鉴定

目的建立基于间接ELISA法的肽扫描与核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance,NMR)技术相结合的方法,鉴定降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)抗体的抗原表位。方法以CGRP各截短片段为包被抗原,间接ELISA法测定2种抗体(新CGRP抗体和对照抗体)与各抗原的结合活性,根据四参数曲线的EC50值分析线性抗原表位。NMR技术采集CGRP的二维氢-氮相关(2D1H-15N HSQC)谱,利用抗体对核磁信号的扰动,分析抗体与CGRP上精氨酸的结合。液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrum,LC-MS)和NMR技术检测精氨酸专属性修饰,通过修饰速率的比对,获得CGRP上2个精氨酸的信号指认。结果2种抗体与CGRP(1-37)、CGRP(19-37)、CGRP(25-37)均存在量效关系,且符合四参数方程,但与CGRP(1-18)、CGRP(19-24)、无C-端酰胺的CGRP(25-37)均无量效关系;确定2种抗体的线性抗原表位均位于CGRP的C-末端。CGRP与对照抗体结合后,2D1H-15N HSQC谱中精氨酸ε-NH的信号消失;CGRP与新抗体结合后,精氨酸信号依然存在;确定抗原上的精氨酸R11和R18可与对照抗体结合,但不与新抗体结合。通过修饰速率的排序比对获得精氨酸ε-NH信号归属,即信号A对应R11,信号B对应R18。结论本研究采用ELISA法与NMR技术相结合鉴定了新CGRP抗体及对照抗体的线性表位和构象表位,为设计新的靶向CGRP抗体药物提供了理论依据。