瑞替普酶融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其复性

目的:为优化瑞替普酶(reteplase,r-PA)在大肠杆菌中的高效融合表达的条件,并提高其复性率。方法:通过改变诱导时间和温度、诱导剂浓度、培养基pH值及氨苄青霉素(Amp)浓度等条件,利用SDS-PAGE分析以上条件的改变对表达产物产量的影响。运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化和复性。结果与结论:LB培养基pH值为6,Amp浓度为100μg/mL,乳糖浓度为5 mmol/L的条件下39℃诱导4 h可获得高效表达的r-PA融合蛋白,其表达量占全菌蛋白的70%,其产物主要以包涵体形式存在。融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化复性,其复性率可达10%,比活为55.7 U/μL。

r-PA真核表达载体的构建与鉴定

用SV40和CaMV35S两种启动子分别启动瑞替普酶(reteplase,rPA)和标记基因bar基因,构建能在海带中表达外源基因的重组表达载体。通过PCR方法扩增CaMV35S启动子、bar基因和rPA基因,将扩增的3个片段分别克隆到pGEMTEasyVector上。将CaMV片段亚克隆到pCAT3control载体上得到重组质粒pCAT/CaMV;再将bar基因切下插入到CAT/CaMV上得到重组质粒pCAT/CB,最后将rPA基因片段切下后插入到pCAT/CB上获得重组质粒pSVrPA/CB。PCR、酶切及测序结果均表明已成功扩增出CaMV35S、rPA和bar基因片段,并已顺次正确插入到真核表达载体PCAT3control上,最终成功构建了能在海带中表达rPA的真核表达载体,用基因枪法转入海带中表达,FAPA法测定得到有体外纤溶活性的阳性海带,为后续研究工作打下坚实的基础。

近年来世界饲料生产状况回顾

近年来，全世界饲料总产量呈稳步增长趋势，尤其是２００２ 年和１９９７ 年均达到了历史最高水平。探讨饲料市场的发展趋势，分析其增长原因以及影响因素，对于我国饲料业发展很有益处，为此，本文的内容值得参考。

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的 2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测 2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门 (Shimen)株进行了比较分析。结果显示 ,GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为 82 .1%和 82 .6 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 87.9%和 88.7% ;GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为 83.6 %和 84 .0 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 89.3%和 90 .1%。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。

硫氧还蛋白-(His)_ 6 融合的瑞替普酶的表达、纯化和活性检测(英文)

目的 :构建硫氧还蛋白 (His) 6 瑞替普酶融合表达载体 ,提高瑞替普酶在大肠杆菌中的表达量 ,简化rPA的分离纯化。方法 :将rPA基因克隆于原核表达载体pET32a硫氧还蛋白 (组氨酸 ) 6标签下游 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中用乳糖进行诱导表达。采用一步稀释法对融合蛋白体外复性后 ,使用Ni2 + 亲和层析柱 ,对包涵体复性液进行初步纯化。采用体外溶圈法对复性后和纯化后的融合蛋白进行生物活性的测定。结果 :得到分子量约为 5 6kDa的融合蛋白 ,表达量达到总蛋白的 30 %以上。比本实验室构建的非融合表达载体表达量提高了约 5 0 %。经过一步Ni2 + 亲和层析 ,融合蛋白纯度达到80 %以上。体外溶圈法实验表明融合蛋白复性后和纯化后具有溶栓活性。结论 :与非融合表达相比 ,融合表达的表达量明显提高。即使N端额外融合一段融合多肽 ,rPA仍然具有生物学活性。

瑞替普酶(reteplase)在海带中表达的鉴定分析

为验证本实验室构建的瑞替普酶(reteplase,r-PA)基因是否成功转入海带,本文通过FAPA、PCR、Southern blotting和Western blotting等方法分别从体外纤溶活性、DNA的整合以及目的蛋白的表达等三个方面进行鉴定,并运用固定化金属离子亲和层析对表达的蛋白进行了初步分离纯化。FAPA结果表明转基因海带蛋白具有溶栓活性,PCR和Southern Blotting显示在1 100 bp处有特异性条带,Western blotting在39 ku处有蛋白条带,证明r-PA基因已成功转入海带而且获得稳定表达,海带中表达的r-PA不需复性就具有溶栓活性,同时说明在r-PA N端设计的(His)6有助于我们利用亲和层析分离纯化目的蛋白。

人重组t-PA突变体与β2糖蛋白Ⅰ的相互作用

利用重组DNA技术和原核表达,得到了人体组织型纤溶酶原激活剂t-PA的缺失型突变体r-PA和Kringle2功能区,并在变性条件下通过金属螯合层析纯化得到纯度较高的r-PA和Kringle2重组蛋白.用纤维蛋白活性平板检测到复性的r-PA和Kringle2都具有体外纤溶活性,并且β2糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein Ⅰ,β2GPⅠ)对r-PA的体外纤溶活性有显著的促进作用:在β2GPⅠ浓度为1μmol/L和4μmol/L时,r-PA的纤溶活性分别提高1.8和2.1倍.ELISA方法检测发现,β2GPⅠ与r-PA,Kringle2均有特异性结合,并且随着β2GPⅠ浓度的增加,它与包被在酶标板上的重组蛋白r-PA和Kringle2的结合都有趋于饱和的趋势,但其饱和浓度却均远高于β2GPⅠ与t-PA结合的饱和浓度.

规模化奶牛场犊牛腹泻产气荚膜梭菌的分离与鉴定

为了确定规模化奶牛场犊牛腹泻的发病原因,采集腹泻犊牛和同群犊牛血清及肛门拭子样品各15份,并采集同舍泌乳母牛所产大罐奶样品100 mL。血清采用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原检测试剂盒检测,肛门拭子和大罐奶样品用牛腹泻五联病原体快速诊断试剂盒检测,对肛门拭子和大罐奶样品进行增菌培养、克隆纯化,并对克隆用毒力基因多重PCR鉴定其毒力型,并用多位点序列分型(MLST)分析其菌群结构。结果显示:血清中未检测到BVDV,而仅腹泻犊牛肛门拭子为产气荚膜梭菌弱阳性,腹泻犊牛及同群犊牛共3份肛门拭子分离到产气荚膜梭菌(阳性率20.0%),大罐奶中未分离到活菌。经毒力基因多重PCR鉴定全部为A型。说明A型产气荚膜梭菌感染是引起犊牛腹泻的主要原因,但经MLST分群,3个克隆不在同一分支,说明产气荚膜梭菌在牛群中存在基因多态性。本研究为规模化奶牛场预防产气荚膜梭菌引起的犊牛腹泻病提供一定科学依据。

一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定

本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法,并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株,命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况,并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞(RAW264.7)中生存能力等与光滑型菌株进行了比较研究。结果显示,试验成功获得了诱导突变株,其缺失片段大小为15070 bp;热凝集试验阳性,能被结晶紫染色,吖啶黄凝集试验阳性;对提取脂多糖进行银染,结果显示O链缺失,诱导株RB71脂多糖不完整;连续传代30次,PCR检测未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,诱导株RB71生长速度显著低于亲本株A19;入侵RAW264.7细胞72 h时,其胞内存活率与亲本株相比极显著下降(P<0.01)。综上所述,本试验开发出一种能高效诱导光滑型布鲁氏菌变异为粗糙型布鲁氏菌的试剂及诱导方法,成功获得一株具有良好遗传稳定性的粗糙型减毒布鲁氏菌RB71诱导株,该诱导株在RAW264.7细胞内的存活能力显著变弱,这为新型弱毒布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技术基础。

我国当前猪瘟疫苗特点及科学免疫

猪瘟是严重危害我国和世界养猪业发展的重要传染病。我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株)在世界范围内的猪瘟免疫防控和最终根除过程中起到了极其重要的作用。尽管如此,目前我国养猪业仍在承受该病的困扰,因种种原因造成的疫苗免疫力下降或免疫失败现象时有发生,每年都让养殖业蒙受巨大的经济损失。文章就我国猪瘟流行特点、现有猪瘟疫苗特点及合理使用猪瘟ST传代细胞苗、科学免疫猪瘟等问题作一概述和探讨分析。

一株鹿源牛种布鲁菌的鉴定及全基因组分析

本研究旨在对一株鹿源牛种布鲁菌(Brucella abortus)BJ1进行全面鉴定,为研究鹿的布鲁菌病提供参考。将B.abortus BJ1培养后,挑取单菌落分别接种到含硫堇或碱性品红的TSA培养基,观察其生长状态;将接种有B.abortus BJ1的TSA平板分别置于普通生化培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅培养基测定B.abortus BJ1生长过程中是否产生H2S;通过结晶紫染色和热凝集试验测定B.abortus BJ1的表型;通过平板凝集试验测定B.abortus BJ1单因子血清反应性;采用AMOS-PCR鉴定细菌种属;为测定其毒力,以1×109CFU感染豚鼠,14 d后测定豚鼠每克脾组织的含菌量。使用二代测序方法测其全基因组序列并对其进行分析和注释,将结果与B.abortus 2308比对,并通过Mauve软件进行系统进化分析。结果显示:B.abortus BJ1不依赖CO2,产H2S,可以在含硫堇和碱性品红的培养基上生长;表型为光滑型,与M因子血清发生凝集;豚鼠脾含菌量为1.17×10^6~2.05×10^6CFU·g^-1;基因组大小为3 270 584 bp,在基因编码区内与B.abortus 2308株相比有46处Indel差异,进化树分析显示与B.abortus 8416有较高的同源性。通过全面鉴定,确定B.abortus BJ1为牛种9型,为更深入地了解我国布病发生情况和鹿的布病防控提供参考。

我国当前猪圆环病毒2型疫苗特点及科学免疫

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原。该病毒可破坏动物机体免疫系统,引起严重的免疫抑制,最终导致猪的生产性能下降、进而造成巨大的经济损失。目前,国内共有6种不同的PCV2疫苗获得了新兽药注册证书。文章就目前国内外PCVD的流行状况、我国当前PCV2疫苗特点及PCVD的科学免疫等方面作一简述,以期为PCVD的疫苗选择和科学防控等提供参考和借鉴。

牛种布鲁氏菌ClpS基因突变株的构建及其对毒力的影响

试验旨在探究ClpS基因在布鲁氏菌中的作用,分析比较ClpS基因突变对布鲁氏菌毒力的影响。利用同源重组技术,构建布鲁氏菌ClpS基因突变株,通过检测细菌生长曲线、细菌LPS合成能力及其在巨噬细胞内的存活能力和小鼠模型中的毒力,比较亲本株2308和突变株ΔClpS两者之间的差异。结果显示,在相同的培养条件下,亲本株2308和突变株ΔClpS的细菌浓度无明显差异,且两者提取的LPS银染结果基本一致,表明ClpS基因突变不影响布鲁氏菌生长速度,不影响细菌LPS合成;在细胞感染模型中,突变株ΔClpS在感染后72 h的胞内存活能力极显著低于亲本株2308(P<0.01);小鼠感染试验显示,在感染后1周,亲本株2308感染组和突变株ΔClpS感染组小鼠脾脏重量及细菌含量无显著差异,但在感染后4周,突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏细菌含量为103.93 CFU/g脾脏,显著低于亲本株2308(106.68 CFU/g脾脏,P<0.01),且突变株ΔClpS感染组的小鼠脾脏肿胀程度极显著低于亲本株2308(P<0.01)。综上所述,布鲁氏菌ClpS基因突变不影响细菌生长速度及细菌LPS合成能力,但ClpS基因突变可降低布鲁氏菌在小鼠脾脏内的定殖能力。

不同免疫增强剂对杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白免疫效果的影响

为了研究不同免疫增强剂对猪圆环病毒2型衣壳蛋白(PCV2-Cap)免疫效果的影响,本研究将BALB/c小鼠随机分为10组,分别为非免疫对照组(Control组),Cap蛋白免疫对照组(Cap组),佐剂疫苗免疫对照组(15A组),以及佐剂组(IL-2组、Poly I:C组、R848组、QuilA组、QS21组、MPLA组)、商品疫苗免疫对照组(Con-V组),选择6种不同的免疫增强剂(IL-2、PolyI:C、R848、Quil-A、QS21、MPLA)分别与等量PCV2-Cap蛋白(15μg/只)混合制备疫苗,免疫BALB/c小鼠,免疫后定期采血,采用相应试剂盒检测PCV2抗体和细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12水平;免疫28 d,对所有小鼠以0.5 mL/只剂量腹腔注射PCV2 SX-07株(1×106.0TCID50/mL),攻毒后21 d采集全血,利用PCR方法检测PCV2病毒血症。结果显示,各佐剂疫苗免疫后对小鼠存在短暂的刺激,但能快速恢复正常,对小鼠安全性优于对照商品疫苗;抗体检测结果显示,首免后21 d,IL-2组、QuilA组和MPLA组小鼠抗体水平高于其他佐剂组,IL-2组、QuilA组均高于Cap组和15A组,且差异极显著(P<0.05),IL-2组、QuilA组和MPLA组高于Con-V组,但差异不显著(P>0.05);首免后28 d抗体检测结果显示,IL-2组、QuilA组、QS21组和MPLA组小鼠抗体水平高于Con-V组,但差异不显著(P>0.05),且所有佐剂组和Con-V组均高于Cap组,且差异均显著(P<0.05);细胞因子检测结果显示,MPLA组小鼠的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12等各细胞因子表达水平均显著高于其他组(P<0.05);QS21组TNF-α的表达水平最高;MPLA、QS21、IL-2、R848诱导小鼠特异性细胞免疫的能力高于商品佐剂和商品疫苗;病毒血症检测结果显示,Control组中小鼠PCV2攻毒后均为PCV2病毒血症阳性,Cap蛋白组中33.3%小鼠为阳性,15A组中16.7%为阳性,其他组均为阴性。综合以上研究结果首次表明,在6种选用的增强剂中,MPLA、IL-2和QS21既能够提高PCV2 Cap蛋白疫苗免疫后机体的抗体水平,又能显著提高免疫后的细胞免疫应答水平,为PCV2亚单位疫苗的新型佐剂后期开发和应用奠定实验基础。

副鸡禽杆菌发酵培养工艺研究

本试验从接种方式、培养时间、初始接种量等方面对副鸡禽杆菌C-Apg-8（A型）的发酵培养条件进行了工艺改进。结果显示,通过将现有副鸡禽杆菌生产的二步接种法（一级种子→二级种子（7 500mL）→300L）改为四步接种法（4mL→160mL→1 600mL→30 000mL→300L）,接种比例由之前的2.5%变为2.5%~10%,培养方式由大瓶培养变为发酵罐培养,同时在不改变单批次发酵总体积、不增加人员和原材料成本的情况下,最终可以使副鸡禽杆菌发酵单批产量增加约5倍。

2013–2017年我国流产奶牛群布鲁氏菌病流行病学趋势与特点

【背景】布鲁氏菌病(布病)是一种由布鲁氏菌引起的严重危害世界很多国家养殖业的人畜共患病。近年来,布病在我国出现反弹趋势,给养殖业发展和公共卫生安全带来严重挑战。由于我国牛羊养殖数量庞大且相对分散等多方面原因,对于动物布病的相关发病数据缺乏完整性和系统性。【目的】了解我国奶牛布病的流行状况,为制定布病防控措施及策略提供数据支持。【方法】根据过去5年(2013-2017)国家动物布病参考实验室的监测数据,深入分析我国奶牛布病发病趋势和流行特点。【结果】2013-2017年,从有流产症状的布病非免疫牛场采集了血清样本23 381份,其中布鲁氏菌血清抗体阳性占44.2%,2015年奶牛布病疫情最为严重,个体阳性率和群体阳性率分别为55.3%和93.5%。一类布病疫区5个省市的流产畜群间布病阳性率介于13.8%-57.8%,二类布病疫区4个省的流产畜群间布病阳性率在54.4%-86.9%之间。在这5年间,人间、流产畜群间布病发病趋势呈高度相关(r=0.806>0)。【结论】流产奶牛群体中,布病发生率处于高流行水平,且与人间布病流行趋势高度吻合;另外,二类布病疫区布病疫情严重。这些重要的信息,有助于全面掌握布病流行情况,提示进行人病兽防的重要性,为制定适合国情的布病防控战略提供技术依据。针对上述研究结果,建议对全国动物布病展开全面监测,做好动物布病预防、准确诊断以及牧场净化等工作。

细菌Lon蛋白酶研究进展

Lon蛋白酶是首个被鉴定的ATP依赖蛋白酶家族成员,在原核生物中发挥着降解错误折叠蛋白、维持胞内蛋白质平衡的作用。最近研究表明Lon蛋白还可以作为压力应激蛋白,参与降解多种转录调控因子和二元调控系统,改变细菌胞内的生理代谢过程以适应环境的改变。本文从Lon蛋白酶的结构、功能与上下游调控网络作一综述,旨在更全面清楚地了解ATP依赖蛋白酶的生理功能,以期为其胞内调控机制研究提供参考。

布鲁氏菌LS蛋白(BLS)研究进展

LS蛋白(2,4-二氧四氢蝶啶合成酶)广泛存在于动物、植物和微生物中,是催化核黄素生物合成的重要合成酶之一。该酶最显著的特征之一是其在不同物种中具有空间结构差异。布鲁氏菌LS蛋白(BLS)是布鲁氏菌的一种优势抗原,是由两个五聚体组成的结构稳定的十聚体。BLS是光滑型和粗糙型布鲁氏菌所共有的抗原,用于布鲁氏菌病的诊断可提高其敏感性;BLS可以激发抗原特异性细胞应答产生IFN-γ,从而对宿主产生保护力,是一种理想的布鲁氏菌病亚单位疫苗的候选蛋白。本文综述了BLS的结构特性及应用研究进展,旨在为BLS的深入研究和开发应用提供参考。

几种重要微生物抗肿瘤作用研究进展

微生物的抗肿瘤作用已被广泛报道,目前,多种微生物已被应用于临床治疗,如卡介苗、Ⅰ型单纯疱疹病毒、腺病毒等。与传统肿瘤疗法相比,微生物疗法具有靶向性好、对机体造成的损伤很小甚至没有、可用于治疗恶性癌症晚期等优点,但是,该疗法在差异较大的个体间临床治疗效果差异较大。研发新型的肿瘤生物疗法,探究其作用机制和途径具有重要的临床意义。现对已报道的微生物抗肿瘤作用及其反应机制进行梳理总结和综述分析,以期为开发新型微生物抗肿瘤疗法和研究微生物、肿瘤细胞、免疫系统三者间相互作用提供参考。