肠道病毒71型感染前后宿主细胞蛋白质组的二维液相色谱分离和比较

以肠道病毒71型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法.该方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离.利用ProteoVue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白.二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2个pH为一个收集区段,在pH8.5～3.9的范围内可见蛋白条带约1 200条.该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路.

一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表达的研究

以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2，转染A549细胞后表达了人白细胞介素-2基因。为应用腺伴随病毒作基因治疗研究提供了实验基础。

非同位素标记探针在脊髓灰质炎病毒型内鉴别中的应用

以脊髓灰质炎(简称脊灰)病毒Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型2500～2600碱基区域(病毒VP1氨基末端)为目的基因片段,人工合成了寡核苷酸引物和探针。以Digoxigenin-11-dUTP代替^(32)P-dATP,建立了Digoxige-11-dUTP末端标记寡核苷酸探针,以及在PCR过程中Digoxigenin-11-dUTP直接掺入扩增产物制备探针的方法,并将探针应用于分离的脊灰野毒株和疫苗相关株的鉴别诊断。Digoxigenin末端标记探针和掺入PCR探针均具有型特异性,用于鉴别我国部分地区分离的脊灰毒株的结果表明,Ⅰ型分离株中90％为野毒株,Ⅱ、Ⅲ型分离株均为疫苗相关株,说明我国近年引起脊灰暴发的仍以Ⅰ型野毒株为主。探针可检测至少10~2～10~3TCID_(50)/ml样品。与同位素标记探针敏感性一致。在PCR过程中直接掺入Digoxigenin标记探针,不需纯化,大大简化了操作步骤,提高了标记效率。Digoxigenin标记探针敏感、特异,对人体无害,不受同位素半衰期影响,可回收反复使用;操作简单,出结果快,易于判断,适合在我国推广使用。

检测人Ⅰ型干扰素生物学活性的新方法

为建立一种更简便、安全、有效的检测Ⅰ型干扰素 (IFN)的方法 ,将可被Ⅰ型IFN诱导的人 6 - 16基因启动子与表达产物容易被检测的 β -半乳糖苷酶基因相连 ,构建成重组质粒 ,然后转染人羊膜传代细胞系 ,筛选阳性克隆 ,最终建立了一种适用于检测Ⅰ型IFN的简便、快速、敏感、特异和重复性好的新型方法 ,其敏感性同标准的细胞病变抑制法相同。

志贺氏菌属各亚群菌株基因组“共有骨架”组成的分析

不同原核生物在基因组组成上的差异是其生物学性状差异的基础,然而,进化中亲缘关系较近的菌群,其基因组除了含有群或株特异的基因外,还含有反映它们起源和进化痕迹的“共有骨架”结构,而这些“共有骨架”恰恰是它们基本生存能力和共有生物学性状的基础.志贺氏菌在起源和进化上与大肠杆菌极为密切,目前倾向于将二者划为同一个种.利用大肠杆菌K～12全基因组及Sf301特异性ORFs的芯片研究了志贺氏菌4个群间的基因组组成.结果显示,分别有16％～22％K-12的ORFs序列没有在志贺氏菌的基因组中被检测出,而志贺氏菌的基因组中包含至少2800个保守的ORFs,组成了其共有的“共有骨架”.进一步分析提示,这些“共有骨架”是维持肠道细菌正常生命生理活动所必需的基本组成此外,只有20％的Sf301特异性ORFs同时存在于其他3个菌株中,揭示了各菌株间基因组的异质性和菌属内的遗传多样性.

福氏2a志贺氏菌301株基因组水平的缺失基因分析

在完成福氏2a志贺氏菌 301株全基因组序列测定工作的基础上, 以非致病性大肠杆菌K12 MG1655株的全基因组序列为参比对象, 进行比较基因组学分析. 结果显示, 与大肠杆菌基因组相比, 福氏2a志贺氏菌 301株基因组中共有136个长度大于1000 bp的片段缺失, 总长为717253 bp. 这些缺失片段中共包含670个可读框(ORF). 通过对ORFs编码产物的功能预测和分析, 发现这些缺失的ORFs主要编码与细菌代谢相关的酶类、结构蛋白、基因转录调控因子以及与细菌遗传物质水平转移相关的元件. 这不仅从全基因组水平揭示了两种具有不同生物学特性和表型的重要肠道细菌的分子差异, 而且为进一步探索其生理活动过程、致病机制以及肠道细菌间的进化等诸方面的问题提供了有价值的线索.

酮古龙酸菌WB0104的全基因组分析

酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp)可以将L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸,具有重要的工业应用价值．酮古龙酸菌WB0104基因组由一长度为2765030 bp的环形染色体和2个环状质粒(267968和242707 bp)组成,染色体的(G+C)含量为61．69%,含2727个可读框(open reading frames,ORF),它的复制、转录和翻译以及碳水化合物和能量代谢系统是完整的,而修复系统不完全．WB0104中有640个左右的预测ORFs属于转运蛋白,占总预测基因数的四分之一左右,远远高于目前已知的其他细菌,推测与其适应土壤环境因素有关．

志贺氏菌属鲍氏(S.boydii)亚群基因组组成与进化分析

利用比较基因组杂交法(comparativegenomichybridization,CGH)对志贺氏菌属鲍氏(S.boydii)亚群共18个血清型代表菌株的基因组结构组成进行比较分析,结果显示,该亚群基因组的“共有骨架”包含2552个与非致病性大肠杆菌K12同源的ORFs.比对K12基因组,该亚群所有菌株基因组共同缺失ORFs为199个,主要涉及外膜蛋白编码基因和O-抗原合成相关基因,而属于亚群特异性的ORFs主要以噬菌体基因和未知功能ORFs为主,一些参与铁离子代谢、运输和Ⅱ型分泌系统基因在大多数的鲍氏菌株中存在.以比较基因组杂交法得到的进化分析显示:鲍氏亚群18个血清型代表菌株可分为4组,其中13型与其他菌株有较大的差异.这种分组结果与某些代谢相关的基因分布情况存在对应关系.通过对该亚群“共有骨架”、缺失基因和株特异基因,以及进化分类等方面的分析,以期探索该亚群基因组的进化规律,并为志贺氏菌属鲍氏亚群的致病机理、疫苗研制和药物开发等方面的研究提供重要线索.

痢疾志贺菌A1型IroN,ShuA单、双突变体的构建及功能分析

构建了痢疾志贺菌A1型SD51197株IroN与ShuA基因缺失及插入的单、双基因突变体MTS-1,MTS-2和MTS．对各突变体在培养基、细胞水平进行了功能检测,并利用SD51197全基因组芯片对各突变株进行了铁丰富和铁限制条件下的表达谱分析．结果显示,在添加铁螯合剂DIP条件下,各突变株生长水平都明显低于野生株,补加铁离子可以使突变株回复到正常生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖和胞间扩散能力实验中,各突变株的生长状态都没有明显变化,但在HeLa细胞侵袭过程中添加DIP,MTS-1,MTS-2和．MTS的胞内存活增殖能力与野生株相比分别下降了23．4％,25．2％和43．6％．铁限制条件下的表达谱结果表明,各突变株对缺铁的变化比野生株更敏感,多个基因的表达发生改变,上调基因主要涉及转录、辅酶代谢、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因主要包括能量代谢和碳水化合物代谢以及功能未分类的基因;已知的转铁相关基因普遍上调．此结果表明,运铁相关基因IroN和ShuA可能影响着志贺氏菌的生长和毒力．

福氏2a志贺氏菌sitC插入突变体的构建、检测及微阵列分析

针对在低拷贝自杀质粒pCVD442中难以进行基因操作的缺陷,将Gateway技术应用在基因敲除前期的重组质粒构建过程.应用这一改进的系统构建了福氏2a志贺氏菌301株转铁相关基因sitC的插入突变体MTS.对突变体分别在培养基、细胞和动物实验水平进行了功能检测, 并利用芯片技术进行了限铁条件下突变体和野生型菌株的表达谱比较.结果显示,在添加150 μmol/L铁螯合剂DIP(2,2’-dipyridyl)条件下,MTS生长水平明显低于野生株,补加铁离子或锰离子可使突变株生长回复到丰富培养基条件下的生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖能力和胞间扩散能力以及豚鼠角膜结膜炎实验中,MTS没有显现出明显的毒力改变,但在HeLa细胞侵袭过程中添加65 μmol/L 的DIP,MTS的胞内存活增殖能力和Sf301相比下降了51.6%.限铁条件下的表达谱结果表明,整体上MTS对缺铁变化比Sf301更敏感,上调的基因比野生株多106个,主要涉及膜转运、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因中参与能量代谢和碳水化合物代谢的较多.缺铁条件下,已知的转铁相关基因普遍上调,且MTS中上调的基因数目及上调幅度要高于Sf301.此结果再次证实了Sit铁转运系统对志贺氏菌生长的重要性.