医学检验专业临床分子生物学检验课程的教学反思

临床分子生物学检验是大理大学医学检验专业的必修课程。针对临床分子生物学检验课程特点和教学实践中存在的问题,从学生正确学习方法和学习目的的培养,教学手段的合理运用,实验教学模式和内容的优化,考试内容和考试制度的改革等方面进行教学总结和反思。结果表明,合理运用多种教学方法,坚持教学反思对提高临床分子生物学检验课程教学质量非常必要。

MTERF2对人子宫颈癌HeLa细胞线粒体氧化磷酸化活性的影响

目的探究过表达或下调线粒体转录终止因子2(MTERF2)基因对人子宫颈癌HeLa细胞线粒体氧化磷酸化活性的影响。方法将人子宫颈癌HeLa细胞分为6组:空白对照组未转染HeLa细胞,阴性对照1和2组分别转染p3×FLAG-CMV-14和pSi-NK,实验1、2和3组分别转染pCMV-MTERF2-FLAG、pSi-MTERF2-1和pSi-MTERF2-2。比较MTERF2蛋白在各组HeLa细胞中的表达情况,并分别检测各组线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ酶活性、线粒体呼吸控制率(RCR)、线粒体跨膜电位、细胞内ATP含量以及线粒体活性氧(ROS)水平的变化。结果实验1组MTERF2蛋白的表达比空白对照组高,实验2和3组MTERF2蛋白的表达水平比空白对照组低(P<0.01)。与阴性对照2组比较,实验1组线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ相对酶活性以及线粒体跨膜电位下降(P<0.01,P<0.05),线粒体ROS水平升高(P<0.01)。与空白对照组比较,实验1组的线粒体RCR和细胞内ATP含量下降(P<0.01)。而实验2和3组上述指标与空白对照组或阴性对照2组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论过表达MTERF2基因能显著抑制子宫颈癌HeLa细胞线粒体氧化磷酸化活性,下调MTERF2基因对线粒体氧化磷酸化活性无显著影响。

法医学专业实验室的体系建构与管理模式探究

高等教育的新设专业实验室建设是新专业建设的重要基础。本文以杭州医学院新开设的法医学专业为例,从校内实验室的硬件、软件、校外实践平台三个方向的建设阐述新专业实验室的体系建构;从实验室的制度、设备、师资团队三方面的建设与管理探讨新专业实验室的管理模式;提出了量化指标和主观评价相结合的建设效果评价体系,为国内高校的新专业建设或法医学专业的实验室建设提供参考。

人线粒体转录终止因子2(MTERF2)在Caski宫颈癌细胞的表达和定位

目的构建人线粒体转录终止因子2(MTERF2)基因真核表达载体,并在人Caski宫颈癌细胞中过表达,观察其编码蛋白质在Caski细胞中的定位。方法从Caski细胞中提取总RNA,采用反转录PCR扩增人MTERF2基因可读框序列,将其重组于p3×FLAG-CMV-14载体中,利用PCR和DNA测序鉴定重组子正确性;并用脂质体法转染至Caski细胞,转染24、32、48 h,采用Western blot法检测MTERF2蛋白水平,通过免疫荧光细胞化学染色观察其亚细胞定位情况。结果经过PCR和DNA测序鉴定,人MTERF2基因可读框正确地插入到真核表达质粒中,大小为1158 bp,表达的蛋白相对分子质量(Mr)为44 000,与预计大小相符。转染p3×FLAG-MTERF2质粒的Caski细胞培养24 h,可检测到目的蛋白表达,该蛋白主要定位于线粒体中。结论在Caski细胞成功表达了MTERF2蛋白并证实其定位于线粒体。

hMTERF3基因启动子区的生物信息学分析

目的:探讨人线粒体转录终止因子3基因启动子区的序列特征、转录因子及其结合位点。方法:利用Promoter 2.0、NNPP、Proscan、First EF软件分别预测hMTERF3基因5端上游的启动子数目及分布;利用CpG Island Searcher和CpG Plot软件预测CpG岛位置;利用P-match 1.0程序搜索TRANSFAC数据库预测与hMTERF3基因启动子结合的转录因子及其结合位点。结果:hMTERF3基因定位于8q21.2,基因全长22 216 bp,含有11个外显子和10个内含子。hMTERF3基因上游至5'侧翼共3 000 bp的核苷酸序列至少存在2个启动子区,其中1 733~2 302 bp之间可能为包含TATA盒的核心启动子区。启动子区序列中存在1个长为1 145 bp的CpG岛。hMTERF3基因启动子区存在1 055个转录因子结合位点,进化足迹法分析其保守的核心启动子区转录因子结合位点共19个。结论:hMTERF3基因启动子区的生物信息学分析能够提高基因启动子的研究效率,为后续实验构建hMTERF3基因启动子表达载体及鉴定启动子功能提供理论依据。

人线粒体转录终止因子3在胃癌组织中的表达及其意义

目的分析hMTERF3 mRNA和蛋白质在胃癌组织及正常组织中的表达,探讨其与胃癌发生、发展的关系。方法分别采用半定量RT-PCR和免疫组化SP法,检测61例胃癌组织及正常组织中hMTERF3 mRNA和蛋白质表达水平,分析hMTERF3表达与胃癌临床分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移的关系。结果 hMTERF3 mRNA和蛋白质在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃组织。hMTERF3蛋白在正常胃组织阳性率为24.6%(15/61),胃癌组织中的阳性率为86.9%(53/61),差异具有统计学意义。hMTERF3蛋白的表达与胃癌临床分期、病理分级、肌层浸润和淋巴结转移有关。结论 hMTERF3蛋白的表达异常可能是胃癌发生、发展的分子机制之一,可为预测胃癌的发生提供可能的生物学标志物,也可为胃癌基因诊断和基因治疗提供潜在的靶标。

利用数据挖掘技术分析HIF-1α在胃癌中的预后意义

目的:基于数据挖掘分析缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)基因在胃癌中的表达及预后意义。方法:利用Oncomine数据库对HIF-1α基因在胃癌中的表达进行荟萃分析;利用c Bioportal在线工具分析TCGA数据库中HIF-1α在胃癌中的突变情况;利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析HIF-1α表达对胃癌患者生存时间的影响。结果:Oncomine数据库荟萃分析发现,共有12项研究涉及HIF-1α在胃癌和正常组织中的表达,包括798例临床样本,与对照组相比,HIF-1α在胃癌中高表达,差异具有统计学意义(P=0.000 216)。Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,肠型、弥漫型及混合型胃癌患者中,与HIF-1α高表达组相比,HIF-1α低表达组胃癌患者的累积存活时间均显著延长(HR<1.0,P<0.05)。结论:通过数据挖掘,提示HIF-1α基因在胃癌组织中高表达,且是胃癌患者预后的保护因素。

MTERF3过表达对脑胶质瘤U251细胞线粒体基因表达及细胞增殖和迁移的影响

目的探讨MTERF3基因过表达对脑胶质瘤U251细胞线粒体基因表达及细胞增殖和迁移的影响。方法以U251细胞作为实验对象,构建MTERF3过表达的U251细胞稳定转染株。实验分为3组:空白对照组(无转染的野生型U251细胞)、阴性对照组(转染EGFP-Flag质粒的U251细胞)、实验组(转染MTERF3-Flag质粒的U251细胞)。采用半定量PCR和Western blot分别检测MTERF3过表达对U251细胞线粒体DNA拷贝量及线粒体编码蛋白的表达水平的影响;采用流式细胞术和XTT法分别检测MTERF3过表达对U251细胞周期及细胞增殖的影响;采用细胞划痕和Transwell小室迁移实验检测U251细胞迁移能力的变化。结果半定量PCR结果显示,与对照组比较,MTERF3过表达显著抑制U251细胞线粒体DNA的拷贝量(P<0.05);Western blot结果显示,与对照组比较,MTERF3过表达显著降低线粒体DNA编码ND1、ND6和CYB蛋白表达水平(P<0.05);XTT结果显示,与对照组比较,MTERF3过表达明显促进U251细胞的增殖(P<0.05);流式细胞术结果显示,与对照组比较,MTERF3过表达能促进U251细胞G1/S转换,未出现细胞周期阻滞和细胞凋亡。Transwell小室迁移实验结果显示,实验组在每个视野下迁移的细胞数[(435.00±42.26)个]显著多于空白对照组[(259.00±30.22)个]和阴性对照组[(252.00±27.58)个],组间差异极显著(P<0.01)。结论 MTERF3过表达对人脑胶质瘤U251细胞的线粒体DNA拷贝量和线粒体蛋白质表达有负调控作用,且上调U251细胞MTERF3的表达使细胞增殖和迁移能力显著提高,并且未出现细胞周期阻滞和细胞凋亡。

数据挖掘技术分析hMTERF1在胃癌中的表达及预后作用

为了探讨人线粒体转录终止因子1(human mitochondrial transcription termination factor 1,h MTERF1)在胃癌中的表达及预后意义,利用Bio GPS数据库分析h MTERF1在正常组织中的表达;利用Oncomine数据库检索关于h MTERF1基因的信息,并对h MTERF1基因在胃癌中的表达进行荟萃分析;利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析h MTERF1表达对不同Lauren分型胃癌患者生存时间的影响。Bio GPS数据库显示,h MTERF1在人体正常组织中均有表达,其中在心肌组织、子宫体和骨骼肌组织中含量较高。Oncomine数据库中共收集了946个不同类型的h MTERF1研究结果,其中关于h MTERF1表达有统计学差异的研究结果有152个,h MTERF1表达增高的研究有59个,表达降低的研究有93个。共有20项研究涉及h MTERF1在胃癌组织中和正常组织中的表达,包括798例临床样本,与对照组相比,h MTERF1在胃癌中高表达,且差异具有统计学意义(P=0.003)。进一步利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析h MTERF1表达对不同Lauren分型胃癌患者生存时间的影响发现,与h MTERF1高表达组相比,h MTERF1低表达组胃癌患者的累积生存时间增高(P=0.045)。在肠型胃癌患者中,h MTERF1高表达胃癌患者的生存时间增高(P=0.028)。而在弥漫型胃癌患者中,h MTERF1低表达胃癌患者的生存时间增高(P=0.024)。在混合型胃癌患者中,h MTERF1高表达患者与低表达患者生存时间的差异无统计学意义(P=0.310)。研究表明,大样本数据挖掘能迅速准确地获取胃癌组织中h MTERF1表达的相关信息,为深入研究h MTERF1在胃癌发生发展中的作用奠定基础。

数据挖掘分析线粒体转录延伸因子在胰腺癌中的表达及意义

线粒体转录延伸因子(mitochondrial transcription elongation factor, TEFM)在线粒体基因转录调控中发挥重要作用,但其在胰腺癌中的表达及意义未见系统研究。本研究利用各种肿瘤生物信息学数据库进行数据挖掘分析TEFM基因在胰腺癌及正常胰腺组织中的表达情况,并进一步探讨TEFM基因对胰腺癌患者预后的影响。利用Oncomine数据库分析TEFM基因在正常胰腺组织和胰腺癌组织中m RNA水平的表达变化。通过基因表达谱动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)人体正常组织和其相应的肿瘤组织中TEFM基因的表达差异。经MethHC分析胰腺癌和正常胰腺组织中TEFM基因DNA启动子区甲基化水平的差异。利用OncoLnc对TEFM基因的表达水平与胰腺癌患者生存率作Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验。在String-DB数据库中探索TEFM基因在线粒体基因转录调控中相互作用的基因。结果显示:与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中TEFM基因在m RNA水平呈高表达,且TEFM基因DNA启动子区甲基化水平升高。TEFM基因的表达水平与胰腺癌患者的总体生存时间无显著相关性。线粒体RNA聚合酶(mitochondrial RNA polymerase, POLRMT)与TEFM蛋白有明显的相互作用。大样本数据挖掘能迅速地获取胰腺癌组织中TEFM基因表达的相关信息,为深入研究TEFM基因在胰腺癌发生发展中的作用机制奠定理论基础。

线粒体转录终止因子3在甲状腺癌中的表达及预后意义

对线粒体转录终止因子3(MTERF3)在甲状腺癌中的表达水平进行分析并评估其预后价值。从TCGA和GTEx等数据库提取甲状腺癌患者MTERF3的表达数据,探究MTERF3在甲状腺癌和癌旁组织中差异表达,分析差异表达对患者免疫细胞浸润和预后情况的影响,并明确MTERF3的临床意义。MTERF3在甲状腺癌中表达水平显著低于正常甲状腺组织,该基因在甲状腺癌中表达较低提示患者预后不良。MTERF3是甲状腺癌的预后标志物,是甲状腺癌诊断和治疗的潜在分子靶标。

hMTERF3基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定带3×Flag标签的人线粒体转录终止因子3基因(hMTERF3)真核表达载体。方法:根据NCBI数据库中hMTERF3基因序列设计引物,采用聚合酶链式反应从pGEM-hMTERF3重组克隆载体中扩增出hMTERF3基因开放阅读框序列,经HindⅢ和Bam HⅠ双酶切后,连接入真核表达载体p3×FLAG-CMV-14的多克隆位点中,构建重组质粒p3×FLAGCMV-hMTERF3,分别用菌落PCR、限制性核酸内切酶分析和DNA序列分析3种方法鉴定重组子。结果:重组质粒p3×FLAGCMV-hMTERF3经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 254 bp的目的条带,DNA序列分析和Blast序列比对结果表明该序列与Gen Bank中hMTERF3基因序列的同源性达到100%,插入基因的大小和方向均正确。结论:成功构建了hMTERF3基因的真核表达载体,为进一步研究hMTERF3基因在恶性肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。

基于ONCOMINE和TCGA数据库分析人MTERF3在子宫颈癌中的表达及预后意义

为了探讨人线粒体转录终止因子3(mitochondrial transcription termination factor 3,MTERF3)在子宫颈癌中的表达及预后意义,检索ONCOMINE数据库中关于人MTERF3的信息,并对目前数据库中资料进行2次分析,对人MTERF3在子宫颈癌中转录水平的表达进行荟萃分析ONCOMINE数据库中共收集了344个不同类型的研究结果。关于MTERF3表达有统计学差异的研究结果总计20项,其中MTERF3表达显著性增高的研究有19项,表达降低的显著性研究有1项(P<0.05)。数据库中共有10个不同的研究涉及MTERF3在子宫颈癌组织中和正常组织中的表达,包括310例临床样本,与对照组相比,MTERF3在子宫颈癌中高表达,且差异具有统计学意义(P=0.036)。通过c Bioportal工具分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的研究发现,MTERF3高表达的子宫颈癌患者与MTERF3低表达的子宫颈癌患者的总生存率(OS)和无病生存率(DFS)均无显著相关性(P>0.05)。通过数据挖掘,揭示人MTERF3在子宫颈癌组织中高表达,但其表达水平与子宫颈癌的预后无明显关联。

人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P<0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。

非小细胞肺癌中人线粒体转录终止因子3蛋白的表达及临床病理学意义

目的人线粒体转录终止因子3(h MTERF3)是线粒体基因表达及氧化磷酸化活性的负调控因子,其在临床肿瘤样本中的表达情况目前少见报道。文中旨在探讨h MTERF3蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中表达及其与临床病理因素之间的关系,揭示h MTERF3的表达在NSCLC中的临床病理学意义。方法实验材料为大理市第一人民医院病理科2008年至2010年存档蜡块,包括65例NSCLC组织和32例癌旁正常肺组织。采用免疫组织化学SP法检测NSCLC组织和癌旁正常肺组织中h MTERF3的表达情况,采用Kaplan-Meier法计算生存率,Cox比例风险模型分析影响NSCLC患者预后的危险因素。结果 65例NSCLC组织中,h MTERF3阳性表达31例(47.69%)。h MTERF3高表达的患者术后生存时间显著低于h MTERF3低表达的患者[(30.09±3.35)月vs(57.61±7.16)月,P<0.05]。h MTERF3阳性表达[HR=3.302,95%CI:1.598~6.905]和淋巴结转移[HR=4.052,95%CI:1.212~12.398]是影响NSCLC患者预后的危险因素。结论 h MTERF3蛋白在NSCLC中的表达水平显著增高,并且h MTERF3阳性表达和淋巴结转移患者生存率会降低。提示h MTERF3可成为肺癌细胞转移的标志物,用于预测NSCLC的预后。

肝癌细胞hMTERF3基因启动子表达载体的构建及其受DNA甲基化的影响

为了筛选人线粒体转录终止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3,h MTERF3)基因各段启动子的活性,探讨肝癌细胞Hep G2和BEL-7402中h MTERF3基因启动子活性受DNA甲基化的影响,首先利用PCR技术扩增h MTERF3基因启动子区,克隆至荧光素酶基因报告载体中,构建p GL6-h MTERF3重组质粒;随后运用荧光素酶检测法检测肝癌细胞中各段h MTERF3启动子对荧光素酶报告基因的启动活性,并采用DNA甲基化酶SssⅠ处理肝癌细胞,观察各报告基因的启动子活性变化。结果显示,成功构建了7个携带h MTERF3基因启动子的重组荧光素酶报告基因载体,重组子经NheⅠ和BglⅡ双酶切及PCR鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测法显示,与p GL6相比,含有P523的3个启动子区段P523、P866、P932有强启动子活性,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。此外,与对照组比较,SssⅠ甲基化酶处理的P523、P866和P932启动子活性显著降低(P<0.05)。以上研究提示,h MTERF3启动子活性受DNA甲基化的影响,其中P523可能是h MTERF3启动子核心,为进一步研究肝癌细胞中h MTERF3基因表达的表观遗传学机制奠定了实验基础。

基于生物信息学分析人类线粒体转录终止因子1基因启动子

目的线粒体转录终止因子1(mitchondrial transcription termination factor 1,MTERF1)编码蛋白质是调控线粒体基因表达和氧化磷酸化的重要因子。文中旨在分析人类MTERF1基因的转录调控序列、转录因子及其结合位点。方法采用进化足迹法,利用生物信息学在线软件对人类MTERF1基因5'端上游的启动子分布、Cp G岛、转录因子及其结合位点进行分析。结果人类MTERF1基因定位于7q21.2,基因全长7845 bp,含有4个外显子和3个内含子。基因上游5'端2500bp的核苷酸序列至少存在2个启动子,其中1878-2447 bp之间可能包含核心启动子。启动子区序列中存在1个长为812 bp的Cp G岛。人类和小鼠MTERF1同源基因存在26个共同的转录因子结合位点。结论生物信息学在线软件能预测人类MTERF1基因启动子和转录因子结合位点,提高了针对该基因启动子的研究效率。

人MTERF3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

目的人线粒体转录终止因子3(mitochondrial transcription termination factor 3,MTERF3)是线粒体基因表达及能量代谢的负调控因子。文中旨在研究大肠埃希菌中原核表达MTERF3蛋白及制备鼠抗人MTERF3多克隆抗体。方法RT-PCR扩增人MTERF3基因c DNA的完整开放阅读框,克隆至原核表达载体p ET28b,转化大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导6×his融合蛋白质表达,Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱亲和层析纯化重组人MTERF3蛋白,以纯化的重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备其特异性多克隆抗体,用ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测抗体的效价和特异性。结果成功在大肠埃希菌细胞中原核表达重组人MTERF3蛋白,并获得高质量的鼠抗人MTERF3多克隆抗体。ELISA结果显示抗体的效价为1∶105,Western blot和免疫荧光结果显示鼠抗人MTERF3能特异性识别天然的MTERF3抗原。结论原核表达的重组人MTERF3蛋白具有良好的免疫原性,其免疫小鼠后获得的多克隆抗体具有高效价和高度的特异性。人MTERF3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备为进一步研究人MTERF3的功能奠定了实验基础。

基于数据挖掘技术分析LKB1在乳腺癌中的表达及预后意义

目的利用数据库分析肝激酶B1(LKB1)在乳腺癌中的表达及其预后意义。方法利用Oncomine和GEPIA数据库分析LKB1基因在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达差异;利用String数据库分析LKB1蛋白与其相互作用蛋白间的调控关系;利用cBioProtal数据库分析LKB1与其共表达基因在乳腺癌中表达的相关性;利用OncoLnc数据库分析LKB1基因在乳腺癌中的表达水平对患者生存预后的影响。结果LKB1在乳腺癌组织中的表达水平低于正常乳腺组织,该基因表达与乳腺癌患者的总生存期(OS)相关(P<0.05)。结论LKB1基因表达水平与乳腺癌患者的生存预后具有相关性,可作为临床诊断的候选基因进行进一步验证。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肿瘤模型中的应用进展

CRISPR-Cas9是一种以细菌和古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的新型基因编辑技术。与传统的锌指核酸酶(ZFN)、胚胎干细胞(ES细胞)打靶和转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比,该基因编辑技术具有操作简单、更加高效、更容易获得纯合子突变体、细胞毒性小、无物种限制等优势,但也存在脱靶效应等缺点。目前,CRISPR-Cas9技术已被广泛用于肿瘤相关研究中,尤其在构建实验动物肿瘤模型中取得许多重要成果。我们主要对CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肝癌模型、结直肠癌模型、肺癌模型、宫颈癌模型、白血病模型、脑瘤模型中的研究现状及应用进展做简要综述。