连接酶检测反应法检测乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药突变的可行性

目的探讨依据寡核苷酸等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)扩增及连接酶检测反应(LDR)方法检测乙型肝炎病毒(HBV)4种核苷(酸)类似物耐药突变的可行性。方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,针对拉米夫啶、替比夫啶、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,同时采用荧光PCR、焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBV DNA>106copy/mL患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致;LDR法与荧光PCR法检测结果一致率达83.3%(10/12)。结论血清HBV DNA>106 copy/mL时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。

不同肝病患者血清抗核抗体谱及抗肝抗原抗体谱IgG检测及其临床意义

目的:探讨抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)谱及抗肝抗原抗体谱IgG在不同肝病患者血清中存在的状况及其临床价值。方法:采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、欧蒙斑点法检测1 190人次肝病患者血清中此两种自身抗体谱,选择阳性者结合生化酶学指标、免疫球蛋白指标进行回顾性分析,研究其与临床诊疗的相关性。结果:277人次(181例)患者血清ANA谱及抗肝抗原抗体谱IgG单项或两项阳性;原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者抗线粒体抗体M2型(anti-mitochondrion antibody-M2,AMA-M2)阳性率96.0%(48/50)、AMA-M2和ANA同时阳性比例46.0%(23/50)显著高于其他肝病组(P<0.01);AMA-M2阳性高滴度比例PBC组显著高于自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)、慢性肝炎(chronic hepatitis,CH)、非病毒性肝炎组(P<0.01);ANA阳性高滴度比例AIH组显著高于CH、肝硬化(liver cirrhosis,LC)、非病毒性肝炎组(P<0.01或P<0.05);AIH、CH、LC、非病毒性肝炎患者血清中检出可溶性肝抗原-胰抗原(anti-soluble liver antigen/liver-pancreas,SLA/LP)、抗肝肾微粒体抗体(liver-kidney microsomes,LKm-1),而PBC组中未检出。AMA-M2和ANA同时阳性与单独AMA-M2阳性的PBC患者间生化酶学、免疫球蛋白水平差异无统计学意义。结论:不同肝病患者血清中存在比例、滴度不同的ANA谱及抗肝抗原抗体谱IgG;AMA-M2检测可作为无创的PBC诊断指标,滴度高低、是否合并ANA阳性与病情严重程度不相关。

核苷(酸)类药与乙型肝炎病毒P基因变异特点及突变频率的关系

目的观察核苷(酸)类药治疗不同时间段慢性HBV感染患者血清乙型肝炎病毒聚合酶(HBV P)基因序列变异特点及突变频率。方法以乙型肝炎病毒全序列为参照,针对P区目的位点,参考引物设计原则,运用焦磷酸测序仪器配套的软件Assay Design SW在目的区域两端保守区域设计PCR引物及测序引物,采用套式PCR方法检测血清中HBV DNA,按照PyroMark ID遗传分析系统用SNP模式进行PCR产物HBVP基因相关位点的焦磷酸测序、突变频率检测,同时测定患者血清HB-VDNA、HBVM、ALT。结果 34例患者中16例发生变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,加少量V173L突变,发生变异者耐药突变型在样本中所占比例由20%到100%;HBVP基因变异可以在HBVDNA、ALT发生突破前、中、后检出;发生HBeAg转化者P基因变异率较低。结论焦磷酸测序可以快速、准确的检测出HBVP基因变异;HBVP基因变异模式、突变频率与核苷类药物敏感性密切相关。