用两种探针对正常与不育男性的白细胞和精细胞基因组DNA进行Southern印渍杂交分析

分子探针在分析尚未弄清楚生化缺陷的遗传疾病上提供了有力的研究工具,它可能帮助寻找生化缺陷的基础,从而提供更合理的诊断和治疗。我们在不明原因男性不育的研究中,见到其配偶具正常生育能力,患者本人精液常规分析数据正常,其不育原因不明,但对不明原因不育男性的基因分析,国内外均尚无报道,也无特异探针。

非小细胞肺癌患者血清中内皮抑素、VEGF水平及其与临床病理生理特征的关系

目的 探讨非小细胞肺癌患者手术前、后血清中内皮抑素 (endostatin)和血管内皮生长因子(VEGF)的动态变化规律及其与肺癌临床病理生理特征的关系。方法 用ELISA法检测 46例非小细胞肺癌患者和 14例肺良性病变患者手术前、后血清中endostatin和VEGF的水平。结果 ①肺癌患者手术前血清中endostatin水平 [( 2 0 .85± 4.5 6) μg/L]和VEGF水平 [( 1.75± 0 .3 7) μg/L ]均显著高于肺良性病变患者[( 15 .68± 2 .78) μg/L与 ( 1.0 5± 0 .3 2 ) μg/L] (P <0 .0 1)。②肺癌患者手术前血清中endostatin和VEGF水平与肺癌原发肿瘤大小、有无远处转移、细胞分化程度和P TNM分期等有密切关系 (P <0 .0 5 ) ,与肺癌原发部位、淋巴结转移状态、组织学类型 ,患者性别、年龄和吸烟与否等无明显关系 (P >0 .0 5 )。③肺癌患者术后 7天血清endostatin水平 [( 2 3 .41± 5 .12 ) μg/L]显著高于术前 [( 2 0 .85± 4.5 6) μg/L] (P <0 .0 5 )和术后 1天血清endostatin水平 [( 18.89± 4.67) μg/L] (P <0 .0 0 1) ;术后 7天血清VEGF水平 [( 3 .75± 0 .71) μg/L]显著高于术前 [( 1.72± 0 .46) μg/L]和术后 1天血清VEGF水平 [( 2 .2 2± 0 .5 8) μg/L] (P <0 .0 0 1)。④肺癌患者术前血清endostatin水平与VEGF水?

人大细胞肺癌细胞系NL9980和L9981的建立及其生物学特性研究

目的 探讨从人大细胞肺癌细胞株WCQH 980 1分离构建不同转移潜能肺癌细胞株的可能性 ,并鉴定其生物学和分子生物学差异。方法 应用单个细胞克隆技术分离建立不同肺癌细胞亚系NL9980和L9981;应用Southernblot、RT PCR、Westernblot检测NL9980和L9981细胞株中nm 2 3 H1基因多态性、mR NA和蛋白转录表达水平 ;应用MTT法、平板法、Boyden小室法、染色体分型法以及动物实验检测NL9980和L9981细胞株的体内体外生物学特征。结果 ①成功分离建立具有不同转移能力的人大细胞肺癌细胞系NL9980和L9981;②L9981细胞系存在nm 2 3 H1等位基因杂合性缺失、mRNA和蛋白表达缺失 ,而NL9980细胞株nm2 3 H1等位基因结构和转录表达均正常 ;③L9981细胞株的体外增殖能力、克隆形成率和体外侵袭力均显著高于NL9980细胞株 ;④L9981细胞株在裸鼠体内的成瘤性和肺部转移率均显著高于NL9980 ;⑤NL9980和L9981染色体众数比较无显著性差异。结论 ①NL9980和L9981细胞株具有不同的生物学和分子生物学特征 ;②L9981细胞株的高侵袭和高转移潜能可能与nm 2 3 H1等位基因缺失有关。

人非小细胞肺癌中FHIT等位基因缺失和突变的研究

目的 探讨FHIT等位基因缺失、突变在肺癌发生、发展中的作用。方法 应用PCR SSCP和DNA序列分析方法对 3 5例人非小细胞肺癌和 4个肺癌细胞株中FHIT基因的 4个外显子 (外显子 3、4、5、8)和微卫星D3S13 0 0、D3S13 12、D3S13 13进行研究 ,并以远癌肺组织和 10例肺良性病变组织做对照。结果 在 3 5例肺癌中 ,2 2例肺癌发生了一个或两个以上的FHIT等位基因缺失 ,缺失率为 62 .86% ( 2 2 /3 5 )。在鳞癌中 ,FHIT等位基因缺失率 ( 88.2 4% ,15 /17)明显高于腺癌 ( 3 8.89% ,7/18) (P <0 .0 1) ;在吸烟患者中 ( 76.19% ,16/2 1)亦明显高于不吸烟患者 ( 4 2 .86% ,6/14 ) (P <0 .0 5 )。而FHIT等位基因缺失与肺癌的细胞分化程度、P TNM分期、原发肿瘤大小、部位、患者性别、年龄及有无转移均无明显关系 (P >0 .0 5 )。Lewis肺癌、A5 49细胞株亦有FHIT基因部分缺失。 4例肺癌组织具有微卫星灶D3S13 12点突变 ,经DNA序列分析显示均为D3S13 12微卫星灶基因的 87位点密码子发生了CT点突变。结论 FHIT基因异常主要以等位基因的缺失为主 ,而点突变发生率较低。FHIT等位基因缺失主要发生在肺鳞癌和吸烟患者中 ,且FHIT基因可能为烟草致肺癌的靶基因 ,其等位基因缺失可能是肺癌的早期分子事件。

非小细胞肺癌患者淋巴结、外周血及骨髓微转移分子诊断在肺癌外科治疗中的作用

目的 探讨检测肺癌患者区域淋巴结、外周血和骨髓中微转移在肺癌外科治疗中的临床意义 ,以及区域淋巴结、外周血和骨髓肺癌微转移三者之间的相关性。方法 应用巢式RT PCR技术 ,对 2 9例肺癌患者和 1 1例肺良性病变患者的淋巴结、外周血和骨髓中CK1 9基因mRNA表达进行联合检测。结果 本实验建立的巢式RT PCR技术的敏感性可达到 1 0 - 6。术前 1 0例患者检测到外周血微转移 ,6例患者检测到骨髓肺癌微转移 ,1 0 1枚纵隔淋巴结中 5 5枚检测到肺癌微转移。肺癌患者淋巴结、外周血和骨髓中微转移阳性检出率分别为 5 4 .5 %、3 4 .5 %和 2 0 .7% ,三者之间存在显著正相关 (P <0 .0 5 ) ,外周血和骨髓微转移与肺癌组织学类型、细胞分化程度及P TNM分期均存在密切关系 (P <0 .0 5或P <0 .0 1 )。结论 RT PCR法是一种特异性 ,敏感性均较高的肿瘤微转移检测方法 ;检测CK1 9mRNA表达应用于肺癌微转移的分子诊断有助于选择外科手术适应证 。

检测CK19 mRNA和MUC1 mRNA诊断非小细胞肺癌淋巴结微转移

目的 探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)淋巴结微转移的基因诊断方法 ,并分析CK19mRNA、MUC1mRNA作为肺癌微转移检测分子标志物的可行性。方法 应用巢式逆转录聚合酶链反应 (nestedRT PCR) ,对 3 1例NSCLC的 119枚淋巴结中的粘蛋白 1(MUC1)mRNA、角蛋白 19(CK19)mRNA表达情况进行检测 ;对照组为 10例肺良性病变患者的 3 5枚淋巴结。结果 3 1例NSCLC患者的 119枚淋巴结中 ,66枚 ( 5 5 .5 %)淋巴结存在CK19mRNA阳性表达 ,65枚 ( 5 4.5 %)存在MUC1mRNA阳性表达 ;肺良性病变患者 3 5枚淋巴结中CK19mRNA和MUC1mRNA表达均为阴性 ,与肺癌组比较均有显著性差异。结论 MUC1、CK19基因均可作为RT PCR法检测NSCLC患者淋巴结微转移的分子标志物 ,两者联合检测可能有助于早期诊断肺癌转移。

人肺癌中nm23等位基因缺失的研究

目的 探讨人肺癌中nm2 3等位基因缺失与肺癌转移的关系。方法 应用Southern印迹杂交对 5 2例人肺癌组织中nm2 3 H1 和nm2 3 H2 等位基因缺失进行了研究 ,并以自身远离癌灶的肺组织作对照。结果 5 2例肺癌中 14例存在nm2 3 H1 等位基因的杂合缺失 ( 2 6.92 % )。 47例有nm2 3 H2 杂交信号的肺癌中 ,2例存在nm2 3 H2 等位基因缺失 ( 4 .2 6% )。伴有淋巴结和 /或远处转移的肺癌中 ,nm2 3 H1等位基因缺失率 ( 4 2 .86% )明显高于不伴有转移的肺癌 ( 8.3 3 % ) (P <0 .0 1) ;低分化和未分化癌nm2 3 H1等位基因缺失率 ( 4 5 .45 % )亦明显高于中～高分化癌 ( 13 .3 3 % ) (P <0 .0 5 )。nm2 3 H1 等位基因缺失与肺癌组织学类型、P TNM分期、原发肿瘤大小、部位 ,以及患者年龄等无明显关系 (P >0 .0 5 )。结论 本研究结果表明nm2 3基因可能参与调控肺癌的细胞分化和转移过程 ,且nm2 3 H1 基因在肺癌转移和细胞分化中的调节作用较nm2 3 H2

nm23-H_1基因对人肺癌细胞中细胞外信号调节激酶活性的影响

目的 探讨肿瘤转移抑制基因nm2 3 H1 对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中细胞外信号调节激酶ERK1/2活性的影响。方法 应用特异性识别总ERK1/2 ( p44 /4 2MAPkinase)和双磷酸化ERK1/2( phospho p44 /4 2MAPkinase)的抗体及蛋白印迹法 (Westernblot) ,检测L9981(缺失nm2 3 H1 基因的原代肺癌细胞株 )、L9981 nm 2 3 H1 (转染了nm 2 3 H1 基因的L9981细胞株 )、L9981 PLXSN (转染了空载体的L9981细胞株 )中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2的水平。磷酸化ERK 1/2活性应用非放射性免疫沉淀和Westernblot法以及 p44 /4 2MAPkinase分析试剂盒予以检测。 结果 L9981 nm2 3 H1 细胞株中磷酸化ERK 1/2的水平 ,以及ERK1/2活性均显著低于L9981细胞株和L9981 PLXSN细胞株 (P <0 .0 1) ,L9981和L9981 PLXSN细胞株间磷酸化ERK 1/2水平和ERK 1/2活性比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。三个细胞株间总ERK1/2水平比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 nm2 3 H1 基因可明显靶向地抑制人高转移肺癌细胞株L9981中ERK 1/2的转录表达和ERK 1/2的活性。推测nm2 3 H1 基因的作用机制可能与其抑制了MAPK/ERK信号传导通路有关。

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的 进一步探讨人原发性肝癌中 p16基因 m RNA转录水平变化与其基因启动子区 Cp G岛甲基化的关系 ,及其在肝癌发生中的意义。方法 采用狭缝印迹杂交检测 2 0例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及 2例正常人肝组织中 p16基因 m RNA表达水平 ,以甲基化特异性 PCR分析各组织中 p16基因启动子区 Cp G岛的甲基化状况 ,并进行统计分析。结果 2 0例人原发性肝癌中 14例 (70 % ) p16 m RNA水平比远癌组织显著降低 ;13例 (6 5 % )显示 p16基因启动子区 Cp G岛甲基化 ,其中 84 .6 % (11例 )伴 p16 m RNA转录水平降低。结论 人原发性肝癌中存在高频率的 p16基因表达失活 ,其主要机制可能是启动子区 Cp G岛甲基化抑制了基因的转录 ,在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。

中药成分CDP抑制肿瘤细胞生长及其去甲基化作用的研究

目的探讨中药成分CDP对肿瘤细胞系的生长抑制作用及其对抑癌基因p 16启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人肝癌细胞系Huh-7和乳腺癌细胞系T 47D,用M TT法检测药物对肿瘤细胞生长的抑制作用;分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytid ine(5-aza-C)作用细胞;同时提取细胞的DNA,用甲基化特异性PCR(m ethy lation-spec ific PCR,M SP)的方法观察肿瘤细胞系p 16基因启动子区CpG岛甲基化/去甲基化的状态。结果①Huh-7和T 47D细胞系皆为抑癌基因p 16启动子区CpG岛完全发生甲基化的肿瘤细胞系。②CDP和5-aza-C以时间、剂量依赖方式抑制Huh-7和T 47D增殖。③在25、50、75和100μm o l/L的CDP持续作用6 d后,Huh-7和T 47D p 16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍然存在;Huh-7在四个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带被扩增出,T 47D则在50、75和100μm o l/L CDP作用下,非甲基化特异性条带被扩增出。④在50μm o l/L CDP作用后,Huh-7和T 47D p 16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍然存在;Huh-7非甲基化特异性条带自12 h出现并持续到144 h,而T 47D非甲基化特异性条带72 h出现并持续到144 h。结论中药成分CDP可以抑制肿瘤细胞的生长并可以逆转高甲基化的p 16基因,具有开发并成为抗肿瘤药物的潜在价值。

nm23-H1等位基因缺失与人非小细胞肺癌转移相关性研究

目的探讨ｎｍ２３－Ｈ１基因缺失与人非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）转移的关系。方法采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ技术检测４６例人ＮＳＣＬＣ组织、癌旁组织ｎｍ２３－Ｈ１等位基因缺失情况。结果４６例肺癌组织中１４例（３０．４３％）存在等位基因缺失。在伴有淋巴结转移者ｎｍ２３－Ｈ１等位基因缺失率为６２．５％（１０／１６），而无转移者为１３．３％（４／３０），两组比较差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。ｎｍ２３－Ｈ１等位基因缺失与肺癌原发肿瘤大小、部位、组织学类型、病理分期及患者年龄等均无明显关系（Ｐ＞０．０５）。结论研究结果表明：ｎｍ２３－Ｈ１基因缺失与人ＮＳＣＬＣ转移有密切关系。

突变k-ras基因重组腺病毒的构建

目的 利用细菌内同源重组法构建含 1 2密码子点突变的k ras基因重组腺病毒。方法 用限制性内切酶kpnⅠ +xhoⅠ从载体pcDNA3 k ras1 2 (Val)中切出 1 2密码子点突变的k ras基因片断 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val) ,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因重组质粒pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒 ,PacⅠ酶切后用脂质体转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒Ad k ras1 2 (Val)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用穿梭质粒pAdTrack CMV中带有GFP报告基因 ,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果 利用CaCl2 法由pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val)和pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,可获得 2 5%左右的阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因 ,滴度为 1 .2× 1 0 1 2 pfu/ml。结论 细菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法 ,具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短的优点 。

利用定点突变技术构建突变nm23-H_1和EGFP融合基因

背景与目的以前的研究已经证明nm23H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23H1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23H1P96S、nm23H1H118F、nm23H1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23H1P96SS120G,构建了突变型nm23H1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23H1S44AEGFP、nm23H1P96SEGFP、nm23H1H118FEGFP、nm23H1S120GEGFP、nm23H1P96SS120GEGFP五个突变型nm23H1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23H1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。

非小细胞肺癌患者淋巴结、外周血、骨髓微转移的MUC1基因诊断及临床意义

目的 :探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)患者淋巴结、外周血、骨髓微转移的MUC1基因诊断的临床意义 ,以及三者微转移之间的相关性。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,联合检测 31例肺癌患者和 10例肺良性病变患者的淋巴结、外周血和骨髓中MUC1基因mRNA表达。结果 :本实验建立的巢式RT PCR技术的敏感性达 10 -6。术前 10例患者外周血、7例患者骨髓检测到肺癌微转移。手术取 119枚淋巴结中 6 5枚检测到肺癌微转移。肺癌患者淋巴结、外周血、骨髓微转移阳性检出率分别为 5 4 .6 %、32 .3%、2 2 .6 % ,三者之间存在正相关(P <0 .0 5 )。结论 :RT PCR法是一种特异性、敏感性均较高的肿瘤微转移检测方法 ;MUC1基因mRNA可能是检测肺癌微转移的一个有价值的指标 ,为制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据。

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5′端上游旁侧序列长约1.1 kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL 3-B as ic的荧光素酶基因上游,构建pGL 3-hTERT p重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A 549、SPC-A-1、LTEPα-2、NC I-H 446、YTM LC-9、GLC-82、95D、A 2以及正常成纤维细胞M RC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-EL ISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1 kb,DNA测序结果与G enB ank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126 bp(-1126^-40),片段长度为1084 bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL 3-hTERT p重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞M RC-5无转录活性。结论克隆的1084 bp大小的hTERT启动子片段在hTERTmRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。

人非小细胞肺癌中FHIT基因转录本异常的研究

目的 探讨FHIT基因转录表达异常在人肺癌发生、发展中的作用。方法 应用nestedRT PCR方法对 3 5例人非小细胞肺癌 (NSCLC)组织、癌旁组织和远癌肺组织 ,10例肺良性病变肺组织以及 4株肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常进行了研究。结果 3 5例肺癌中 14例肺癌组织存在FHIT转录表达异常 ,异常率为 40 % ;在这 14例癌组织转录本异常病例中 ,5例癌旁组织亦见转录本异常( 3 5 .71% ,5 /14 )。远癌肺组织和肺良性病变组织均未见转录本异常。 4株肺癌细胞株均检测到转录本异常。在鳞癌中FHIT基因转录本异常率 ( 5 8.82 % )显著高于腺癌 ( 2 2 .2 2 % ) (P <0 .0 5 )。FHIT基因转录本异常与肺癌细胞的分化程度、P TNM分期、原发肿瘤大小、肿瘤部位 ,以及患者年龄等均无明显关系 (P>0 .0 5 )。结论 本研究结果表明在NSCLC中存在FHIT基因转录表达异常。FHIT基因异常主要发生在肺鳞癌中 ,且可能是肺癌发生的早期分子事件。

Smad3D和Smad7重组腺病毒载体的快速构建

目的 简化重组腺病毒载体的构造方法 ,构建含Smad3DcDNA或Smad7cDNA的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法 以AdEasySystem为基础 ,应用序贯化学转化方法 ,在大肠杆菌E .coliBJ5 183体内将携带目的基因的穿梭质粒和骨架质粒重组。结果 成功构建了重组腺病毒载体pAd Smad3D和 pAd Smad7及空腺病毒载体 ,并经酶切鉴定证实。结论 用序贯化学转化方法 ,可以快速高效地在大肠杆菌内构建重组腺病毒载体。

肺癌组织中Endostatin mRNA转录表达与血清Endostatin水平关系的相关性研究

目的:探讨非小细胞肺癌患者肺癌组织中EndostatinmRNA转录表达水平与血清中内皮抑素(Endo-statin)水平的关系以及两者水平与肺癌临床病理生理特征的关系。方法:用ELISA法检测46例非小细胞肺癌患者血清中Endostatin的水平;用RT-PCR法检测其肺癌组织中EndostatinmRNA的转录表达水平。结果:1)肺癌患者血清中Endostatin水平为20.85±4.56ng/ml;肺癌组织中EndostatinmRNA的转录表达产物的OD比值为0.872±0.071。2)肺癌患者血清中Endostatin水平及肺癌组织中EndostatinmRNA的转录表达水平均与肺癌原发肿瘤大小、有无远处转移、细胞分化程度和P-TNM分期等有密切关系(P<0.05),而与肺癌原发部位、淋巴结转移状态、组织学类型,患者性别、年龄和吸烟与否等均无明显关系(P>0.05)。3)肺癌组织中CollagenⅩⅧ/EndostatinmRNA的转录表达与血清中Endostatin水平呈非常显著正相关(r=0.686,P<0.01)。结论:肺癌患者肺癌组织中EndostatinmRNA的转录表达与血清Endostatin水平有非常显著正相关关系,且均与肺癌的发生、发展、远处转移和细胞分化不良有密切关系,非小细胞肺癌患者血清中Endostatin水平和肺癌组织中EndostatinmRNA的转录表达水平可能是预测肺癌恶性行为的有用指标。

人胚牙釉质蛋白质的分离纯化

选择5～9月龄人胚标本,按照 Lyaruu 方法分离出与牙釉质晶体结合疏松的釉原蛋白及结合紧密的釉蛋白。经葡聚糖凝胶 G—75层析后得到初步纯化的牙釉质蛋白质。釉原蛋白经凝胶柱层析后可分成9种组份,其分子量范围为5000～65500,主要的两种釉原蛋白分子量为22000及13000;釉蛋白可分成4种组份,分子量为10000～50000。从牙釉质蛋白质的氨基酸分析发现,釉原蛋白富合脯氨酸、谷脯酸及甘氨酸,而釉蛋白则含较多的丝氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸及异亮氨酸。