HPLC法测定对羟基苯甲酸甲(丙)酯、阿斯巴甜

目的 同时测定液态食品和可溶性固态食品中的对羟基苯甲酸甲（丙）酯、阿斯巴甜的含量。方法 高效液相色谱法。结果 样品加标回收率为91％～104．3％，RSD〈3％。结论 该法操作简单、方便，令人满意。

IC法测定矿泉水中溴化物含量的不确定度评定

目的求离子色谱法测定矿泉水中溴化物含量的不确定度,以确定结果的可信程度和准确性。方法依据《饮用天然矿泉水》(GB8538-1995)规定的方法进行测量,比较全面的考虑整个分析过程的不确定度来源,建立其测定结果的数学模型。结果该方法测定的某矿泉水中溴化物含量的相对标准不确定度为2.5%;扩展不确定度为0.08mg/L。结论提出的方法可适用于离子色谱法测定矿泉水中溴化物含量的不确定度评定。

2014年长沙市禽类场所环境H9N2亚型禽流感病毒分子流行特征分析

目的了解2014年长沙市禽类场所环境中H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和非结构蛋白(ron-structural,NS)基因的分子进化特征,为人感染H9N2亚型AIV防控提供实验室科学证据支持。方法对2014年长沙市禽类场所中采集的501份环境标本(禽类饮水263份,污水221份,其他标本17份)利用real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,然后对单独H9阳性标本利用HA和NA基因通用引物进行RT-PCR扩增和核苷酸测序,病毒HA、NA及NS基因测序结果在线BLAST分析,利用Bioedit和Mega5软件进行氨基酸比对和进化树构建。结果从501份环境标本中检出A型AIV核酸阳性标本350份,H9亚型核酸阳性标本191份,占总标本数量的38.12%,H5亚型核酸阳性标本177份(35.33%),H7亚型核酸阳性11份(2.20%),H5和H9亚型混合核酸阳性标本68份(13.57%)。部分单独H9亚型核酸阳性标本经RT-PCR和核苷酸测序鉴定出阳性H9N2亚型病毒核酸标本23份,分子进化分析表明2014年长沙市禽类场所环境中的绝大部分H9N2亚型AIV HA、NA、NS基因来源于A/Chicken/Shanghai/F/98(F98)类似株病毒,属于新的S基因型,HA蛋白受体结合位点(Receptor binding site,RBS)第235位(对应H3流感第226位)氨基酸为Leu(L),表现为特异性结合人流感病毒受体特征,病毒HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为低致病性的分子特征。结论 2014年长沙市禽类场所环境中H9亚型AIV核酸阳性率最高,H9N2亚型AIV的HA、NA和NS基因表现为低致病性的分子特征,但具有容易感染人类的特征,需要进一步加强监测。

2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析

目的分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征。方法从2014年长沙市活禽市场采集501份环境标本,利用Real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,并对单一H5阳性标本进行核苷酸测序,病毒HA、NA和NS基因测序结果进行在线BLAST分析,利用Mega5和Bioedit软件构建核苷酸进化树和氨基酸(Amino acids,aa)比对。结果从501份环境标本中检出A型H5亚型病毒阳性标本177份(检出率35.33%),其中8份标本经核苷酸测序鉴定为H5N1亚型病毒,进化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支内,聚集形成一个新亚分支,NA及NS基因位于2.3.2.1b亚分支。HA蛋白受体结合位点aa为QSG,表现为禽流感病毒受体特征;NA蛋白未出现H275Y及N295Saa替换,对神经氨酸酶抑制剂敏感;HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为高致病性的分子特征。结论 2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA和NS基因表现为高致病性的分子特征,但不具有对人易感的受体特征,需要进一步监测。

志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌LAMP检测方法的建立及应用

目的建立针对侵袭性质粒抗原H(ipaH)编码基因的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法利用LAMP方法对4株志贺菌、1株肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和20株其他肠道菌DNA在65℃恒温扩增30min或60min后观察结果。结果 4株志贺菌和EIEC可通过肉眼和电泳观察到阳性结果,而其他肠道菌为阴性。LAMP检测特异性与聚合酶链反应(PCR)相似,但敏感性比PCR高10倍。LAMP、PCR检出下限分别为1.2×102、1.2×103CFU/mL。LAMP和分离培养法对70例食物中毒患者和健康者肛拭子标本检测结果符合率为100%。结论 LAMP由于具有快速和无需特殊仪器的优点,可广泛用于肛拭子标本志贺菌和EIEC的检测。

猪链球菌长沙分离株的鉴定与16S rRNA系统进化分析

目的对2株猪链球菌(Streptococcus suis,SS)长沙分离株进行分离培养和分子鉴定,并对其16SrRNA基因进行测序,阐明其系统进化关系。方法利用分离培养法对2株SS进行分离鉴定,同时对分离株16SrRNA基因进行PCR扩增和核苷酸序列测定,将测序结果提交GenBank,通过在线Blast同源性分析进行菌株鉴定,并与传统培养鉴定方法进行比较,利用Mega4.0软件构建SS长沙分离株系统进化树。结果成功扩增出2株菌的目的片段,通过测序后Blast同源性分析,证实2株菌株均为SS,且与传统鉴定方法结果一致,进化树显示长沙2株SS和国内外2型位于同一进化分支上,同四川的05ZYH33参考株亲缘关系最近。结论通过16SrRNA基因可以准确快速鉴定SS,可应用于应急检测,长沙2株猪链球菌属于SS2型,与其他SS2分离株16SrRNA基因同源性高,未发生变异。

3株人源猪链球菌2型湖南株cps2J、gdh、ef基因进化分析

目的对3株人源猪链球菌2型(S.suis 2)湖南株(HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102)cps2J、gdh、ef基因进行序列测定和进化分析,了解其变异和进化状况,为人感染S.suis疫情的防控提供数据。方法设计S.suis 2 cps2J、gdh、ef基因PCR引物,对HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株进行PCR扩增和序列测定,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行分析。结果 cps2J、gdh、ef基因包含的完整开放阅读框(ORF)分别为999bp、1 347bp、2 532bp,分别编码333、448、843个氨基酸。在线BLAST同源性分析表明,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株属于S.suis 2,3菌株cps2J、gdh、ef基因组序列之间的核苷酸同源性均为100%;进化树显示,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株与国内外猪源和人源S.suis 2菌株属于同一分支,同源性比较显示3株S.suis 2湖南分离株cps2J、gdh、ef基因与其他国内外S.suis株核苷酸序列同源性分别为99.8%～100%、96.4%～100%和99.7%～100%,氨基酸同源性分别为98.5%～100%、98.7%～100%和99.5%～100%。结论 3株人源S.suis 2湖南株cps2J、gdh、ef基因序列与国内外S.suis 2菌株相应基因序列同源性高,变异程度小。

毛细管色谱法测定车间空气挥发性有机物

目的为制革企业车间空气中的多种有害污染物,提供快速准确的定性、定量分析方法。方法用活性炭管采集被污染车间中一定量的空气,用热解吸仪解吸,在毛细管柱气相色谱仪上进行分析。测定其方法的工作曲线、最低检出限、相对标准偏差、测量范围、解吸效率、回收率、稳定性等。结果2004年11月和12月,分两次分别对两家制革企业车间空气,用此法成功进行了监测分析。结论此法对存在多种有害成分污染的车间空气,用活性炭管采样后,进行分析,试验结果符合实验方法的要求。用热解吸法,无毒、快速。

实验室仪器设备标识管理方法探讨

实验室仪器设备的管理，是实验室顺利开展各项工作的基础和关键，实施仪器设备的标识管理，是检查仪器设备处于受控管理的措施之一。不论是实验室资质认定还是实验室认可，都把设备作为技术要求之一。并对设备标识管理有具体要求，在《检测和校准实验室能力认可准则》（ISO／IEC17025：2005）中5．5．4款要求“用于检测和校准并对结果有影响的每一台设备及其软件，如可能，均应加以唯一性标识”；5．5．8款要求“实验室控制下的需校准的所有设备，只要可行，应使用标签，编码或其他标识表明其校准状态，包括上次校准的日期、再校准或失效日期”。

长沙市部分塑料食品容器卫生质量调查

随着化学合成工业的高速发展，以塑料制成的食具和食品容器已逐步取代我国传统使用的以竹、木、铁、玻璃和纸张等材料制成的食具和容器。为了解塑料食品容器的卫生质量，我们于１９９６年１～１０月进行了抽样调查，现将结果报告如下。１内容与方法１．１随机抽取我市国营...

液质联用法快速、同时测定水中的呋喃丹、莠去津、西维因和微囊藻毒素LR

目的为提高实验室水质检测效率,研究建立快速、同时测定水中呋喃丹、莠去津、西维因和微囊藻毒素LR的HLB固相萃取柱富集净化-液相色谱质谱联用分析的方法。方法水样品经0.45μm滤膜过滤后,通过Waters HLB固相萃取柱富集和净化,以Waters ACQUITY UPLCBEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱柱为分离柱,以乙腈-0.1%甲酸为流动相,梯度洗脱,质谱仪以MRM模式检测,分析时间仅为2.5 min。结果呋喃丹、莠去津和西维因的线性范围为4 ng/L^400 ng/L,微囊藻毒素LR的线性范围为20 ng/L^2 000 ng/L。呋喃丹、莠去津、西维因和微囊藻毒素LR的平均加样回收率分别为88.82%、86.42%、82.92%和98.43%,相对标准偏差为1.49%~7.78%。结论本方法能有效提高实验室水质检测效率,且方法的定量下限远低于国家标准规定的最高限量,具有较好的检测灵敏度。

10种食源性疾病病原体高通量LAMP分子鉴别检测体系的建立及应用

目的建立一种LAMP分子鉴别检测体系,应用于10种食源性疾病病原体的分子鉴别检测。方法针对8种细菌（沙门菌属、志贺菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、EHEC O157：H7、奇异变形杆菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌）和2种病毒（Norwalk病毒和轮状病毒）分别建立LAMP和RT-LAMP方法,分别对25种常见肠道细菌和病毒进行LAMP扩增,水浴箱内65℃扩增60 min（LAMP）或120 min（RT-LAMP）,扩增完成后利用电泳和肉眼进行结果判断。对365份食源性疾病患者呕吐物、肛拭子和食品等标本进行10种食源性疾病病原体LAMP分子检测。结果 10种食源性疾病病原体LAMP或RT-LAMP方法均只对靶病原体出现阳性结果,电泳显示为LAMP特异性梯状条带,加SYBRGreen I后肉眼观察反应液变为绿色;8种细菌性病原体LAMP检测方法的敏感度为3×100~1.2×102cfu/ml,其中6种LAMP方法敏感度高于PCR方法,其他病原体（霍乱弧菌、EHEC O157：H7、Norwalk病毒和轮状病毒）敏感度与PCR方法相同。从365份标本中检出沙门菌属11份、志贺菌属6份、金黄色葡萄球菌13份、EHEC O157：H7 2份、副溶血性弧菌2份、单增李斯特菌2份、Norwalk病毒12份和轮状病毒7份。结论建立了一个较为完整的LAMP分子鉴别检测体系,可以在一台水浴箱内同时对10种食源性疾病病原体进行高通量的分子鉴别检测,具有快速、不需要特殊仪器和肉眼判断结果的优势,适合基层单位的实验室开展食源性疾病的分子鉴别诊断。

2012年长沙市手足口病病原学分析

目的了解2012年长沙市手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的病原构成。方法采集HFMD患者咽拭子或粪便样本,提取病毒核酸,实时荧光RT-PCR检测人肠道病毒(human enterovirus,HEV)、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)核酸;兼并引物扩增非EV71、非CVA16型肠道病毒VP1区,序列测定和BLAST比对确定其型别。结果2012年共采集HFMD病例样本746例,实时荧光RT-PCR检测201例EV核酸阴性,545例阳性,核酸阳性率为73.06%;EV核酸阳性样本中,364例为EV71阳性,占66.79%;84例为CVA16阳性,占15.41%;97例为非EV71、非CVA16型肠道病毒,占17.80%。2012年全年均可检测到阳性病例,主要集中在4~6月,共检出阳性样本220例,占EV阳性的40.37%;其中,有498例患者为年龄5岁以下的婴幼儿,占91.38%,为主要感染人群。非EV71、非CVA16型肠道病毒经普通RT-PCR扩增,44例样本扩增出目的片段,BLAST比对确定病毒型别分别为:CVA6 22例,CVA10 19例,分别占阳性样本的4.04%和3.49%;而CVA12、CVB3、ECHO16目前各检出1例。结论 2012年引起长沙市HFMD的病原型别多样,但以EV71为优势型别。

紫锥菊植物提取物中乙醇与乙酸乙酯溶剂残留量的测定

目的建立顶空气相色谱法测定紫锥菊提取物中乙醇与乙酸乙酯残留量的测定方法。方法以SPB-5(30m×0.32mm×0.25μm)为色谱柱,FID检测器结合顶空进样器进行气相色谱分析。结果在优化条件下,方法的线性较好,样品的加标回收率在98%～100%之间,相对标准偏差小于5%。结论本方法可以快速、准确的测定紫锥菊提取物中的乙醇与乙酸乙酯的残留量。

长沙市活禽市场人H9N2亚型禽流感感染来源的研究

目的探讨人H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的感染来源。方法对2014-2015年长沙市活禽市场环境开展AIV核酸监测,收集全球人感染H9N2 AIV病例数据,利用MEGA 6软件对全球人感染H9N2 AIV、活禽市场环境H9N2 AIV和部分禽H9N2 AIV血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)及非结构蛋白(nonstructural protein,NS)基因进行进化分析。结果 2014-2015年长沙市活禽市场环境中H9 AIV的核酸阳性率最高(占44.76%),污染较为严重。全球共报告27例人感染H9N2 AIV病例,绝大多数病例经治疗后康复,流行病学调查显示59.26%(16/27)的病例明确有禽类或活禽市场暴露史。HA、NA及NS进化分析显示2013-2016年分离自湖南、广东的人源H9N2 AIV分离株与湖南和广东辖区活禽市场环境中分离到的H9N2 AIV亲缘关系近,核苷酸相似性高达97%~99%。结论活禽市场是人H9N2 AIV的感染来源之一。

长沙市家禽市场环境中H5N1亚型禽流感病毒传播风险研究

目的对长沙市家禽市场职业暴露人群进行禽流感病毒（AIv）H5N1亚型抗体水平和环境AIV核酸检测，并对环境中AIVH5N1亚型的血凝素（HA）基因进行测序分析。方法抽取长沙市1个区和1个县，各选择2个城区或乡镇家禽市场进行职业暴露人群H5N1抗体和环境AIV核酸检测。利用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）对102份家禽市场职业暴露人员血清标本进行H5N1抗体检测，real-time PCR方法检测160份家禽市场环境标本（污水、禽类粪便、羽毛和禽类笼具表面涂抹标本）AIV核酸，对4份污水H5N1亚型AIV核酸阳性标本进行HA基因RT-PCR扩增和TA克隆测序，测序结果利用Lasergene和Mega5．0软件进行氨基酸比对和进化树构建。结果AIVH5N1抗体监测结果显示，家禽市场职业暴露人群血清H5N1抗体阳性率为25．5％（26／102），其中乡镇和城区家禽市场职业暴露人群阳性率分别为50．0％（9／18）和25．4％（17／67），乡镇家禽市场职业暴露人群阳性率高于城区。长沙市家禽市场环境中H5亚型AIV核酸阳性率为3113％（50／160），其中乡镇家禽市场阳性率为37．3％（31／83），高于城区家禽市场24．7％（19／77）；不同标本H5亚型AIV核酸阳性率不同：污水（50．0％，24／48）、羽毛（44．5％，4／9）、禽类粪便（29．8％，14／47）和禽类笼具表面涂抹（14．3％，8／56）；差异均有统计学意义（P〈0．01）。TA克隆测序得到4个AIV H5N1亚型HA基因序列，进化树显示4个AIV H5N1亚型HA基因与中国内地和香港禽来源的AIV分离株为同一分组，属于欧亚分支；4个AIVH5N1亚型HA基因受体结合位点氨基酸序列仍然为禽源（QSG）、HA1和HA2蛋白之间连接肽为多个碱性氨基酸序列（RERRRKK或RERRGKK），与人源AIV H5N1亚型具有相同的受体结合位点和高致病性的分子特征。结论长沙市家禽市场环境中存在较多数量的AIV H5N1亚型，是导致职业暴露人群抗体阳性率达25．5％的原因之一；环境中存在的AIV H5N1亚型HA基因表现出来的高致病性分子特征，增加了家禽市场环境中发生AIV传播的风险。

长沙市2010年手足口病EV71型VP1区基因序列分析

目的了解2010年长沙市手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）重症和普通病例肠道病毒71型（human Enterovirus 71,EV71）VP1区基因特征。方法收集12例HFMD重症和普通病例的咽拭子或肛拭子标本进行VP1区基因RT-PCR扩增和核苷酸序列测定,测序结果利用sequin软件提交至GenBank,Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对分析和构建进化树。结果 12株EV71 VP1区基因序列在进化树上与C基因型中的C4a亚型代表株属同一分支,在核苷酸同源性分析中,12株EV71与C4a亚型代表株（3254-TAI-98）的同源性达到92.6%-93.3%,高于与A、B、C1、C2、C3、CVA16型或亚型代表株的同源性（分别为79.9%-80.7%、83.1%-84.0%、87.9%-88.7%、89.1%-89.8%8、7.8%-88.2%和57.3%-58.4%）;12株EV71病毒VP1之间的核苷酸有高度的同源性：同源性为98.1%-100.0%,高于与C4亚型代表株的同源性（92.6%-93.3%和91.8%-92.7%）。2010年分离自长沙的重症和普通病例与2008年分离自北京、深圳和阜阳的EV71病毒VP1基因序列之间的氨基酸变异位点少。结论 2010年长沙市流行的EV71型病毒属于C基因型中的C4亚型;12例HFMD重症和普通病例的EV71 VP1区基因序列差异较小;不同时间、不同地区和不同病例来源的EV71 VP1区氨基酸变异位点无关联。

家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析

对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险。9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析。共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/Hubei/w h/1999)aa同源性分别为90.1%～92.5%和91.0%～92.6%,8个H5N1的NS1和NS2aa之间的同源性分别为93.8%～100.0%和98.4%～100.0%。8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征。家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒。

长沙市2013-2014年麻疹野毒株与疫苗株的快速鉴定与分析

目的了解2013-2014年长沙地区是否存在疫苗株感染,建立实验室快速鉴别麻疹野毒株与疫苗株方法。方法按照《全国麻疹监测方案》,采集麻疹疑似病例咽拭子标本,应用RT-PCR方法进行麻疹病毒核酸检测,再从麻疹病毒核酸阳性病例的咽拭子标本中提取核酸,采用转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(reverse transcription-polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,RT-PCR-RFLP)方法进行疫苗株和野毒株的快速鉴定和基因序列分析。结果共采集到697份麻疹疑似病例的咽拭子标本,检出224份麻疹病毒核酸阳性,9例出现麻疹临床症状的患者有麻疹减毒活疫苗(measles attenuated live vaccine,MV)接种史。经RT-PCR-RFLP方法鉴定,均为野毒株感染。测序及序列比对分析结果显示均为H1a基因型。结论 2013-2014年长沙麻疹疑似症状者及9例MV接种史患者均为野毒株感染。成功建立RT-PCR-RFLP方法区别疫苗株与野毒株的感染。

2016年长沙市重组诺如病毒引起的胃肠炎暴发疫情调查

目的了解2016年长沙市诺如病毒引起的2起胃肠炎暴发疫情特征。方法采集腹泻患者肛拭子或粪便标本,提取核酸后采用实时荧光RT-PCR检测诺如病毒GI/GII型;采用特异性引物分别扩增病毒ORF1、ORF2、ORF1-ORF2连接区,测序后,通过BLAST比对和NoV typing online tool确定病毒基因型别,采用MEGA 5.0软件进行序列比对和系统进化分析。结果两起疫情均发生在幼儿园,患儿均集中在其中一个班级,临床特征以呕吐、腹痛腹泻为主。实时荧光RT-PCR检测共有5份标本为诺如病毒GII型阳性,分子分型显示其中一起疫情2份阳性标本为GII.p12/GII.3重组型,系统进化分析该毒株与中国北京、无锡及日本、泰国等分离的GII.p12/GII.3重组型诺如病毒同源性为94%-99.5%。另一起疫情3株阳性标本为GII.p16/GII.2重组型诺如病毒,分子进化显示该毒株与同时期中国、日本、德国、法国等地暴发流行的GII.p16/GII.2重组型诺如病毒同源性为98%-99.5%。结论 2016年长沙市出现GII型诺如病毒引起的胃肠炎疫情暴发流行,且病毒存在抗原重组,其中GII.p16/GII.2重组型病毒已造成全球范围内的暴发流行,应加强其病原学监测和分析。