牙鲆dazl基因的克隆与表达分析

dazl(deleted in azoospermia-like)基因是多种物种精子发生的重要调控因子,为探讨该基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺发育分化中的作用,本研究采用同源克隆和RACE技术克隆了牙鲆dazl基因的cDNA序列,利用生物信息学方法分析了其序列结构,并利用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现:牙鲆dazl cDNA序列全长2 031 bp,包括105 bp的5'端非翻译区,1 275 bp的3'端非翻译区和编码217个氨基酸残基的651 bp开放阅读框;氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的RRM(RNA recognition motif)结构域,且该结构域在鱼类中具有100%的序列一致性;荧光定量PCR结果显示dazl基因主要在牙鲆性腺中表达,且在精巢中的表达高于卵巢;在牙鲆早期发育阶段,dazl基因在未受精卵、受精卵及囊胚期均有较高的转录本,而在原肠胚期表达开始降低,至孵化后3 d一直保持较低的水平,这些丰富表达的母源性dazl mRNA可能参与了胚胎发育中原始生殖细胞的形成。本研究为进一步阐明dazl基因在牙鲆生殖发育中的功能奠定了基础。

应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定

以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2,emx2)为例,构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体,以期应用于mi RNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总RNA,参照已克隆出来的emx2基因c DNA序列,设计并合成emx2 3'UTR片段的引物并进行PCR扩增,将得到的基因片段和psi CHECK-2载体双酶切后,用T4 DNA Ligase酶进行连接反应,并转化入DH5α感受态细胞,筛选后得到野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区,并将emx2 3'UTR区的mi RNA靶点序列GACTTGA突变为AGTCCAG,成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的mi RNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于mi RNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体psi CHECK-emx2-3'UTR和psi CHECK-mutated-emx2-3'UTR。

我国高科技企业成本粘性案例浅析

在日趋复杂的经济环境中,成本粘性应引起企业管理层的高度重视,做好成本管控,确保企业的盈利水平和未来发展趋势。现深刻解读成本粘性的界定及影响因素,运用案例分析证实成本粘性的存在性。

研发费用加计扣除对企业总体税负的影响分析

随着我国不断出台鼓励企业研发创新各项优惠政策,有关研发费用税前加计扣除的税收政策则成为各方关注的重点。本文运用理论推演、统计分析深入阐述并验证了研发费用对降低企业总体税负水平的显著影响,是实现避税要求的手段,应引起税务机关充分重视,加强研发项目的税收征管和处罚力度,以防止企业管理层自利行为对国家财政收入的不利影响。

递延税项是否是操控利润的盈余管理新手段

本文运用理论推演、统计分析深入阐述并验证了递延税项产生于会计准则与企业所得税法的差异,是会税差异的核心构成;递延税项影响企业的盈余水平,已经成为公司管理层盈余管理的新手段。对此,监管机构应充分重视,加大对企业的监管和处罚力度。