新型冠状病毒不同分支传播现状及传播特性的研究

目的分析新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)不同分支自暴发至今的时空分布变化规律,以及潜在的人群感染偏好。以期为病毒的传播规律、致病机制、针对性防控提供线索。方法从全球疫情共享网站GISAID来源的元数据的信息中筛选出性别、年龄、病毒株型等信息。聚类分析SARS-CoV-2的7种分支(L、S、V、O、G、GH、GR)随时间的占比变化。以年龄段(0~19岁、20~39岁、40~59岁、≥60岁)和性别分组,计算比较各组中7种分支的分布差异。结果所有7种分支全部于2020年1月底前被检出,分支L、S、O随时间的变化逐渐减少,G系列分支逐渐增多,现为全球主要流行株系。7种分支在各年龄段的分布比较差异有统计学意义(P=0.000),在性别之间的分布比较差异无统计学意义(P=0.114)。结论SARS-CoV-2具有高传播力和突变速度,G系列分支可能由于其独特的突变位点、复杂的环境因素等成为世界流行株,SARS-CoV-2的各分支具有感染的年龄偏好,但不具有性别偏好。

mRNA疫苗及其作用机制的研究进展

目前,重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)仍在全球迅速蔓延,给人类生活带来了巨大的健康隐患和经济负担,接种疫苗是预防和控制该病毒传播的重要途径。mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体,直接进行翻译,形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。mRNA疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗后的第三代疫苗,具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、易规模化扩大等特点。本文就mRNA疫苗的免疫学特性、分子设计、递送系统、安全性的研究进展及其相应机制作一综述。

单价和五价轮状病毒疫苗保护效果的Meta分析

目的 评价两种主流轮状病毒疫苗Rotarix和RotaTeq对重症轮状病毒胃肠炎和任意严重程度轮状病毒胃肠炎的流行病学保护效果.方法 检索2006年1月至2017年10月公开发表的有关这两种疫苗流行病学保护效果的随机对照试验文献,采用RevMan 5.3软件和STATA 11.0软件进行Meta分析.结果 共纳入12篇文献,总研究对象为53 573人.对于重症轮状病毒胃肠炎,汇总的保护效果为85％（95％CI：74％～92％）;在发达国家或地区汇总的保护效果为92％（95％CI：88％～94％）;在中国广西的汇总保护效果为75％ （95％CI：63％～83％）.对于任何严重程度的轮状病毒胃肠炎,汇总的保护效果为67％（95％CI：53％～77％）,在发达国家或地区的汇总保护效果为76％（95％CI：72％～80％）;在中国广西的汇总保护效果为64％（95％CI：54％～72％）.结论 这两种轮状病毒疫苗都能有效预防重症轮状病毒胃肠炎的发生,对任意严重程度轮状病毒胃肠炎也有较好的保护效果.

四价流感病毒灭活疫苗在18~64岁人群免疫原性和安全性的系统综述和Meta分析

目的用Meta分析的方法评价四价流感病毒灭活疫苗在18~64岁人群的免疫原性(抗体保护率和抗体阳转率)。方法检索Medline、Cochrane Library、Science Direct数据库,将近10年内发表的比较18~64岁人群接种四价流感病毒灭活疫苗和三价流感病毒灭活疫苗免疫原性的临床随机对照试验纳入分析。采用Revman 5-3软件对纳入文献数据进行Meta分析。结果共纳人8篇文献,针对甲型流感株(A/H1N1、A/H3N2)的抗体保护率和抗体阳转率,两种疫苗的反应差异无统计学意义;针对不含乙型流感株B/Victoria的三价流感病毒灭活疫苗,四价流感病毒灭活疫苗抗体保护率的合并RR值为1.28(95%a:1.08~1.51,P<0.05),抗体阳转率的合并RR值为1.94(95%CI:1.50~2.50,P<0.05);针对不含乙型流感株B/Yamagata的三价流感病毒灭活疫苗,四价流感病毒疫苗抗体保护率的合并RR值为1.10(95%CI:1.02~1.18,P<0.05),抗体阳转率的合并RR值为1.99(95%CI:1.34~2.97,P<0.05),差异有统计学意义。结论18~64岁人群中,四价流感病毒灭活疫苗与三价流感病毒灭活疫苗对于相同的疫苗株产生的免疫原性无差异,对于三价流感病毒灭活疫苗中不含的乙型疫苗株能产生良好的免疫效果。

悬浮MDCK细胞培养H7N9流感病毒时TPCK胰酶添加量的优化研究

目的探讨在悬浮MDCK细胞中培养H7N9禽流感病毒时最佳的TPCK胰酶添加量。方法在细胞生长期和产毒期,添加不同浓度的TPCK胰酶,每12 h取样监测其对细胞生长的数量、活率、葡萄糖和乳酸的代谢以及血凝滴度的影响,并对TPCK胰酶的批间差异做一探索。细胞生长期胰酶的添加量为0、1、2、4、6、8、10、15μg/ml;产毒期胰酶的添加量为0、0.5、1、1.5、2、2.5μg/ml。出现血凝滴度同等情况时,以MOI为0.001、0.005、0.025、0.05再次进行优化。结果未见TPCK胰酶浓度对细胞数量、活率、葡萄糖和乳酸代谢明显的线性影响;在TPCK胰酶浓度高达15μg/ml时,也未见其对细胞生长的毒性。接种H7N9禽流感病毒后,1、1.5、2、2.5μg/ml的胰酶添加在48 h都达到了最高的滴度,为1∶26.5,在60 h,后两种添加浓度的血凝滴度下降快于前两种添加浓度;MOI为0.005时,1.5μg/ml的胰酶添加在48 h产生的血凝滴度26.5高于同等条件下1μg/ml的26的血凝滴度。在TPCK胰酶不同批次中,有批间差异的存在。结论1μg/ml和1.5μg/ml的胰酶添加可更好地促进H7N9禽流感病毒增殖,但1.5μg/ml的添加有更广谱的MOI适用性。

细胞培养流感病毒H5N1的纯化方法研究

目的降低H5N1甲型流感病毒中宿主细胞残留蛋白质和DNA含量。方法首先使用Core 700分子筛去除宿主残留蛋白质,再使用Capto Q阴离子交换层析柱去除宿主残留DNA,对多批次MDCK细胞培养的H5N1病毒液进行纯化。纯化后的病毒液经荧光定量PCR、血凝试验、单扩试验等结果综合评价纯化效果。除层析外,本实验还设置了广谱核酸酶对照组。结果在不使用广谱核酸酶的条件下,宿主DNA去除率为99.62%,宿主蛋白质残留去除率为98.1%,血凝素(HA)抗原回收率为66.96%。结论本研究提供了一套对于以细胞基质制备的流感疫苗有较好效果的纯化策略,宿主细胞的DNA和蛋白质有较高去除率,且HA回收率较高,纯化结果不劣于添加广谱核酸酶的方法,有可能应用于实际疫苗生产。

H1N1疫苗株在MDCK和MDCK-G1细胞中的培养条件比较

目的比较H1N1流感病毒疫苗株在MDCK和MDCK-G1细胞中的最佳培养条件、产毒量、病毒滴度和细胞代谢情况。方法通过棋盘法摸索两种细胞的最佳种毒条件,然后比较2株细胞在最佳条件种毒后的血凝滴度、半数组织感染剂量(TCID50)、葡萄糖和乳酸的代谢情况。结果MDCK-G1细胞以感染复数(MOI)=0.001、1μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后,72 h时血凝滴度达到峰值(1∶512),病毒滴度为107.4TCID50/ml;MDCK细胞以MOI=0.0001、1μg/ml TPCK胰酶接种H1N1流感病毒后,72 h时血凝滴度达到峰值(1∶256),病毒滴度为106.6TCID50/ml。结论MDCK-G1比MDCK细胞更适合流感病毒的增殖。本研究为细胞基质流感疫苗的研究提供了参考数据。

胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾细胞消化方法的研究

目的考察不同胰蛋白酶及消化后是否弃去胰蛋白酶对Madin-Darby犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞消化效果的影响,并评价培养基中添加胎牛血清对减轻胰蛋白酶细胞毒性的作用。方法选用5种胰蛋白酶分别消化MDCK细胞,消化5 min后弃去胰蛋白酶为弃去组,不弃去为保留组。观察消化过程,记录细胞达到不同状态所需的时间。完全消化后,检测细胞的活率、结团率、直径。以不同浓度的胰蛋白酶消化MDCK细胞,按培养基是否添加胎牛血清分为含血清和无血清组,检测细胞活性。结果重组胰蛋白酶消化时间长于动物源胰蛋白酶。保留和弃去组细胞活率均值都大于94.77%,结团率均值均大于34.56%,直径均值分别为17.33和16.97μm且差异有统计学意义(t=4.632,P<0.001)。细胞活性随胰蛋白酶添加量呈现梯度变化。含血清和无血清组的细胞活性差异有统计学意义(t=12.545,P<0.001)。结论5种胰蛋白酶均可完全解离贴壁MDCK细胞,其中重组胰蛋白酶消化时间较长,作用温和,比较适合生产。弃去胰蛋白酶再继续消化的做法可行且有益,胰蛋白酶浓度对细胞活性有影响,胎牛血清可以减轻胰蛋白酶的潜在毒性。

H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCK-G1细胞上的遗传稳定性

目的分析H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCK-G1细胞上的遗传稳定性。方法将H5N1种子毒株在MDCK-G1细胞上传代,收获病毒液作为P2病毒,继续传至P15,每隔5代[即P1(原代)、P5、P10、P15]进行测序。分别以含不同浓度(1、2、4μg/mL)TPCK-trypsin的培养基及不同病毒接种MOI(1、0. 1、0. 01、0. 001、0. 000 1、0. 000 01)在MDCK-G1细胞上培养P1 H5N1病毒,检测血凝滴度,计算CCID50,确定最适MOI及TPCK-trypsin浓度。将P1和P15 H5N1病毒接种鸡胚,收获尿囊液,经Sepharose 4 Fast Flow凝胶柱层析法纯化病毒后,进行电镜观察;采用培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)检测支原体。结果 H5N1流感病毒疫苗株(NIBRG-14)在MDCKG1细胞传代过程中血凝滴度增加,从1∶128升至1∶1 024,P1、P5、P10和P15 H5N1种子病毒8条基因序列(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS)经DNAMAN比对结果一致。H5N1种子病毒株在MDCK-G1细胞传代的最适TPCKtrypsin浓度为4μg/mL,最适MOI为0. 001。两种方法检测P1、P15 H5N1种子病毒株均未被支原体感染。结论H5N1种子病毒株在MDCK细胞中传至P15时,病毒滴度增加但基因序列未发生改变,表明H5N1种子病毒株在MDCK-G1细胞中传代具有一定的遗传稳定性。

人用H5N1禽流感病毒疫苗生产工艺的优化

目的 建立优化的人用H5N1禽流感病毒疫苗生产的工艺。方法 在不同的稀释倍数、收获时间及灭活剂添加量下,通过测量收获液的病毒滴度和血凝效价,来确定病毒的最佳生产条件,并对离心法和凝胶过滤层析法的纯化效果进行对比。结果 103~104半数鸡胚感染量(50% egg infective dose,EID50)病毒接种鸡胚,收获的鸡胚尿囊液的病毒滴度和血凝效价最高,分别为10-8.3EID50和1∶480;在56~72 h血凝效价最高。甲醛浓度1∶10 000灭活144 h为灭活最佳条件。两种纯化方法得到的样品纯度和卵清蛋白的去除率相近,但离心纯化法和凝胶过滤层析纯化法病毒回收率有较大的差异,分别为19%和70%。结论 成功建立了高产毒的鸡胚基质H5N1禽流感病毒培养、灭活及纯化工艺。