诱导多能干细胞在遗传性心脏疾病模型中的应用与机制

背景:遗传性心脏病具有较高的患病率及死亡率,至今其发病机制仍未阐明。尽管部分遗传性心脏病已经建立了相应的动物模型,为研究遗传性心脏病的发病机制提供了一定的基础,但是由于物种间的差异等原因显著降低了这些研究结果的价值,因此,需要全新的模型来探索其发生发展过程。目的:综述了目前诱导多能干细胞在构建多种遗传性心脏病模型中的作用和潜在的应用前景。方法:第一作者于2023年1-3月期间应用计算机在Pub Med数据库中检索近13年的相关文献,以“induced pluripotent stem cell,inherited heart disease,congenital heart disease”等为检索词,最终纳入76篇文献进行分析。结果与结论:自2007年诱导多能干细胞从人体体细胞中诱导建立以来,已有许多针对疾病特异性诱导多能干细胞的研究报道。由于疾病特异性诱导多能干细胞能够再现疾病表型,因此有望成为体外疾病建模的一种新研究工具,用于分析发病机制和研制辅助药物。在心血管遗传性疾病的研究方面,从患者特异性诱导多能干细胞分化得到的心肌细胞中含有参与心脏发育异常相关的基因突变,因此,其可作为一种全新的工具研究遗传性心脏病的潜在机制。到目前为止,诱导多能干细胞来源心肌细胞已被广泛用于多种遗传性心脏疾病的分子机制研究,如心脏电生理性疾病、心肌病以及一些综合征性遗传性心脏疾病。

溶酶体半乳糖脑苷酯酶的作用机制及疾病

溶酶体贮积症(lysosomal storage diseases,LSD)是一类遗传性代谢障碍疾病,其发病机制主要源于溶酶体酸性水解酶的基因突变,导致酶的功能缺陷,进而触发生物大分子在溶酶体内的异常积累,继而对细胞、组织及器官功能造成显著损害。β-半乳糖脑苷酯酶(galactocerebrosidase,GALC)的突变或缺失导致鞘氨醇半乳糖苷(galactosylsphingosine)的累积,造成了进行性的脱髓鞘病变,诱发神经鞘脂贮积症-克拉伯病(Krabbe disease),其在疾病调控中的具体机制尚未完全阐明。目前,越来越多的有关GALC基因的致病突变被报道,结合GALC蛋白的三维结构解析,已逐渐了解GALC蛋白的突变造成克拉伯病的机制,这将为开发相关治疗药物提供有力的证据。此外,GALC在不同的肿瘤进程中扮演着双重角色,一些癌症中充当着抑癌因子的作用,而在另一些癌症中则发挥着致癌因子的作用,然而剖析GALC对癌症的影响仍需进一步深入的研究,这将为GALC作为潜在的肿瘤促进或抑制的靶点提供借鉴。GALC还与多种神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病、帕金森氏病以及多发性硬化症有关。由于GALC作用机制的复杂性,目前,针对GALC缺乏所致的克拉伯病的治疗主要通过单一模式疗法(single-modality therapies)及多模式疗法(multi-modality therapies),但要开发出真正有效的治疗方法,仍需深入研究GALC基因缺陷导致的发病机制。本文综述了GALC的结构和功能特性,汇总并讨论了其在神经系统及肿瘤发生发展中的作用及相关研究的最新进展,旨在为未来深入探讨GALC的调控机制及开发治疗相关疾病的创新药物提供理论基础和参考。

肠道菌群代谢物脱氧胆酸对人脐带间充质干细胞hUC-MSCs增殖及细胞周期的影响

目的探讨肠道菌群代谢物次级胆汁酸DCA不同浓度和不同作用时间在体外环境下对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)增殖和细胞周期的影响。方法CCK8及流式细胞仪检测在含不同浓度DCA(0.00µmol/L、1.56µmol/L、3.13µmol/L、6.25µmol/L、12.50µmol/L、25.00µmol/L、50.00µmol/L、100.00µmol/L、200.00µmol/L、400.00µmol/L、800.00µmol/L)干细胞培养基中培养hUC-MSCs 24 h、48 h、72 h后,干细胞增殖及细胞周期的变化。结果脱氧胆酸对hUC-MSCs增殖的影响体现在DCA剂量和作用时间两方面(两者交互作用,F=6.622,P<0.001);当浓度一定时,时间越长,细胞增殖越多;当作用时间一定时,浓度越高,细胞增殖抑制。浓度一定时,随时间的增加,细胞阻滞在G0/G1期的比例增加(P<0.001);不同作用时间DCA对hUC-MSCs的细胞周期表现为低浓度组细胞阻滞在G0/G1期和S期,高浓度组细胞阻滞在S期和G2/M期(P<0.001)。结论体外环境下,DCA对hUC-MSCs增殖及细胞周期的影响与浓度和作用时间相关。

母传甲型肝炎抗体衰减过程分析

目的:了解母传甲型肝炎抗体衰减过程,为制定科学的免疫程序提供依据。方法:采集310名0～24月龄健康儿童血清,测定抗HAV总抗体,分析不同月龄组的抗体水平。结果:<1个月龄组甲肝抗体阳性率和几何平均滴度(GMT)均最高,分别为98.04%和2451.55mIU/ml,之后逐渐下降,12个月～组降至最低,12个月～和18～24个月龄组间甲肝抗体阳性率和GMT差异均无统计学意义。结论:12～24月龄应为甲肝疫苗免疫的最佳时期。

甲型肝炎灭活疫苗抗原剂量的优化

目的通过体内效力实验,优化甲肝灭活疫苗抗原最适免疫剂量。方法用1.0mg/ml Al(OH)3将不同梯度剂量的实验苗及参比苗4倍递增系列稀释,经腹腔免疫小白鼠,4周后采血,检测各免疫组小鼠血清甲肝抗体阳转率,用Reed-Muench法计算半数有效稀释倍数,比较抗原免疫剂量与半数有效稀释倍数之间的剂量-效应关系。结果甲肝灭活疫苗实验苗抗原免疫剂量与半数有效稀释倍数之间存在着良好的剂量-效应关系。结论半数有效稀释倍数可用于不同品牌甲型肝炎灭活疫苗效力的评价及最适抗原免疫剂量的优化。

IL-2和IL-15诱导的CIK细胞联合化疗治疗直肠和结肠癌的临床疗效

目的探讨IL-2+IL-15共同刺激CIK(Cytokine induced killer cell)过继性免疫治疗联合化疗对结直肠癌的疗效及安全性.方法选取在昆明市延安医院医院普外1科治疗的110例结直肠患者,55例CIK联合化疗组,55例行单纯化疗组,评价2组患者治疗后免疫功能、疗效、毒副反应和生活质量.结果 IL-2+IL-15刺激的CIK细胞较单纯IL-2刺激细胞具有较强的细胞毒性和较快的增殖效率;CIK联合化疗组治疗前后外周血T细胞亚群均有升高,但差异无统计学意义(P>0.05),化疗组治疗后外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、NKp46、NKG2D、CD11b、CD27细胞比例较治疗前下降;联合免疫治疗组与单纯化疗组治疗后Kamofsky评分总提高率分别为87.3%与69.1%,2组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 IL-2+IL-15刺激CIK过继性免疫治疗联合化疗可以明显改善结直肠癌患者的免疫功能,提高总体疗效,减轻化疗不良反应,延长无进展生存,改善患者生活质量.

甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)和灭活疫苗(L8株)诱导小鼠体液及细胞免疫应答

目的评估甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗的免疫学效果。方法用甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)和灭活疫苗(L8株)分别经腹腔免疫BALBc小鼠后,用ELISA法检测血清中抗HAVIgG、TNFα、IFNγ和IL2;用流式细胞仪对全血中T细胞亚群分类;3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖。结果减毒活疫苗组在初免后诱导的体液和细胞免疫水平均低于灭活疫苗组,加强免疫后,与灭活疫苗相当。灭活疫苗组IFNγ的峰值出现时间较减毒活疫苗组晚,但水平较高。结论两种疫苗均可诱导体液和细胞免疫应答,减毒活疫苗进行加强免疫后可诱导更好的系统免疫应答。

甲型肝炎灭活疫苗有效剂量的评价

目的 评价佐剂吸附甲型肝炎成品疫苗有效免疫剂量。方法 将 4个厂家的 4批甲型肝炎灭活疫苗进行解离吸附后 ,检测比较HAV抗原含量 ;通过小白鼠体内效力实验 ,计算半数有效稀释倍数 ,比较评价各组疫苗的免疫效力。结果 体外吸附解离HAV抗原含量与体内免疫效力相偏离 ,传统概念上的半数有效剂量 (ED50 )不能用作比较评价指标。结论 体内半数有效稀释倍数可用于甲型肝炎灭活疫苗有效剂量的评价。

CIK细胞治疗泌尿系统肿瘤的临床疗效分析

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)体外细胞毒活性,并观察CIK细胞治疗泌尿系统肿瘤的近期临床疗效、免疫学活性及副反应.方法 2007年7月至2010年3月共收录10例泌尿系统肿瘤患者进行CIK细胞治疗,经标准治疗方案治疗的患者,取外周血分离单个核细胞(PBMC),体外诱导出CIK细胞培养后,观察CIK细胞表型,用MTT法测体外细胞毒活性.结果当效靶比为16:1、8:1时,CIK细胞体外细胞毒活性杀伤率分别(93.59±6.69)%和(76.78±14.23)%.前列腺癌2例,病情有较好的缓解,其中1例前列腺特异抗原和游离抗原治疗后均下降;4例肾癌完全缓解,1例SF,AFP和CEA在CIK治疗3个疗程后降至正常值.膀胱癌4例,部分缓解3例;与CIK细胞回输前相比,患者CD3+、CD4+、CD8+均有显著升高(P<0.05),这表示可以诱导患者产生特异性的免疫反应.10例患者在输注CIK过程中未出现不良反应.结论 CIK细胞在泌尿系统肿瘤免疫治疗中能诱导机体产生特异性的免疫反应,亦是新的杀伤肿瘤细胞的效应细胞,有较好的临床疗效.

人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究

目的研究脐带间充质干细胞(UC-MSCs)在体外分离、培养、扩增和鉴定以及向神经元分化的方法.方法 30例符合入选标准的脐带采用贴壁法分离得到UC-MSCs,选用20%FBS血清培养液进行原代培养,再选用10%FBS扩增培养液进行一般传代.用神经分化培养基诱导UC-MSCs向神经细胞分化,在荧光显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察UC-MSCs超微结构,用流式细胞仪分析其表面特性,采用直接和间接免疫荧光法检测细胞悬浮液的表型特征,用抗人神经纤维M、突触素、微管蛋白、半乳糖神经酰胺的单克隆抗体检测各代之间神经诱导形成率.结果 12 h后细胞开始贴壁生长,超微结构观察表现出未分化细胞的特征,CD123、CD49、CD29、CD73和CD166均为阳性,免疫荧光检测人UC-MSCs分化成神经细胞.结论 UC-MSCs长期传代培养,生物学特性稳定,具有向神经细胞分化的潜能.

不同疗程CIK治疗患者的CIK细胞的细胞毒活性研究

目的探讨不同疗程CIK治疗肿瘤患者CIK细胞体外抗肿瘤作用的差异.方法分离多疗程和单疗程CIK治疗肿瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC),加入细胞因子诱导CIK细胞,用MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀伤活性,用流式细胞仪检测其免疫表型.结果不同疗程患者的CIK细胞对肿瘤细胞都有一定细胞毒活性,当患者行多疗程治疗时,效靶比在4:1、8:1和16:1时,对BGC-823和SPC-A-1的细胞毒性较单疗程强,但以SPC-A-1低效靶比4:1时差异更为明显.另外,多疗程组的CD3+CD56+细胞含量显著高于单疗程组(P<0.05).结论多疗程CIK治疗患者的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果强于单疗程CIK治疗患者,多次CIK治疗延长肿瘤患者生存期,提高生活质量,对肿瘤复发有较好的作用.

2种口服甲型肝炎疫苗免疫应答效果评价

目的研究甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗口服免疫效果。方法将甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗口服免疫Balb/c小鼠,并检测免疫后抗甲型肝炎总抗体I、gA和sIgA,外周血淋巴细胞亚群,脾淋巴细胞增殖反应和细胞因子干扰素-γ(IFN-γ),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)水平。结果2种疫苗口服免疫后均能诱导体液、细胞和局部免疫应答;但含铝佐剂的甲型肝炎灭活疫苗口服免疫,诱导抗体水平较低,但可诱导较好的细胞免疫应答。结论口服免疫可以作为甲型肝炎疫苗有效的免疫途径之一。

超大容量非免疫人源性Fab抗体库的构建

目的构建超大容量非免疫人源性Fab抗体库。方法通过RT-PCR从208名不同人的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库。结果成功地构建了库容量为2.6×1012的人源性Fab段噬菌体抗体库。结论新的噬菌体抗体库对筛选不同抗原位点的抗体,提供有用的资源。

风湿性二尖瓣狭窄患者外周血细胞因子的基因表达谱

目的利用基因芯片技术,比较风湿性二尖瓣狭窄病人和健康人外周血细胞因子基因表达的差异,从整体上认识风湿性二尖瓣狭窄的心脏瓣膜病的细胞因子表达状况。方法单纯性二尖瓣狭窄的病人3人,以健康人5人作为对照,应用Trizol法分别提取他们的外周血总RNA,逆转录合成cDNA,用Cy5、Cy3分别标记病人、对照组的cDNA,混合后在细胞因子表达谱芯片上杂交。结果经对原始数据的标准化和SAM芯片数据软件的应用,获得CXCR4,RGS2和IRAK13种显著性差异表达的细胞因子基因,均为表达上调的细胞因子基因,并对各自的作用进行归纳、分析。结论获得风湿性二尖瓣狭窄外周血细胞因子的基因表达图谱,并证实了风湿性二尖瓣狭窄的心脏瓣膜病是炎症反应和抗炎反应相互作用的结果,为进一步临床研究该病与细胞因子的关系提供一定的方向。

CIK细胞杀瘤实验前后细胞表型与细胞毒性相关性研究

目的为了分析体外细胞因子诱导培养CIK细胞在体外杀瘤实验中的细胞表型变化与其杀瘤活性的相关性及为临床过继免疫治疗提供实验依据。方法采用体外诱导方法扩增培养正常人外周血淋巴细胞及单个核细胞,用CCK-8试剂检测培养14d的CIK细胞对SPC-A-1和BGC-823肿瘤细胞的细胞毒活性,应用流式细胞术测定杀瘤实验前后CD3+等6种不同表型细胞百分率的变化。结果在与效靶比成正比的条件下,体外实验CIK细胞对两种肿瘤细胞的杀伤率都与CD3+CD4+,CD3+CD4-CD8-细胞比例变化呈正相关(P<0.05),都与CD3+CD25+,CD3+CD28+,CD3+CD25+CD28+细胞比例变化呈负相关(P<0.05),对SPC-A-1细胞的杀瘤率与CD3+CD16+CD56+呈正相关(P<0.05)。结论本研究表明靶细胞抗原在活化细胞中起重要作用,测定培养细胞活化相关表型可以间接监测其杀瘤能力,为临床CIK细胞过继免疫治疗的应用提供实验依据。

甲型肝炎病毒抗原定量参比品的研制

目的制备甲型肝炎病毒抗原定量参比品.方法依据<甲型肝炎灭活疫苗制造及检定规程>制备了1批甲肝病毒抗原参比品,并进行蛋白质含量测定、HAV蛋白纯度分析和酶标抗原含量标化.结果经纯化,杂蛋白去除率达99.9%,参比品的纯度大于95%;抗原含量在20～80EU/ml范围内,抗原含量的对数与其A值呈剂量-效应关系.结论该参比品可用于甲肝病毒ELISA定性及定量标定.

人外周血淋巴细胞体外诱导培养前后的差异蛋白组学研究

目的研究人外周血淋巴细胞(PBMCs)体外诱导前后的蛋白质组表达变化,进一步探讨其抗肿瘤机制。方法收集培养前后的细胞提取总蛋白,定量、双向电泳和银染后,利用ImageMasterTM软件对表达异同的蛋白质点进行分析及质谱鉴定。结果培养前后细胞相似的蛋白主要与基因转录因子和细胞骨架相关,差异蛋白主要与细胞凋亡和代谢相关。结论 CIK细胞的扩增及表型变化与细胞内蛋白表达改变相关。

BEL-7402细胞系基因表达谱的分析

目的使用基因芯片对BEL-7402细胞系和正常肝组织的基因表达谱作分析。方法提取BEL-7402细胞及正常肝组织RNA逆转录用dUTP-cy5、dUTP-cy3分别标记cDNA探针,用基因芯片检测与肿瘤相关的866个基因的表达。结果BEL-7402细胞系与正常肝组织比对发现31个基因有表达差异;其中上调24个,下调7个。这些差异表达的基因多与细胞周期调控、受体表达及免疫相关。结论从实验中发现的表达差异的基因有利于干预癌细胞周期调控和信号通道的各个环节,为肿瘤药物的研发和治疗提供基本信息。

自体骨髓干细胞肝移植治疗晚期肝硬化1例报道

病例 男，59岁。因“发现慢乙肝20余年，腹泻，乏力，纳差，腹胀加重1周。”以“乙肝后性肝硬化失代偿期”收住。入院查体：T37．4℃，R20次／min，BP130／70mmHg，HR80次／min。一般稍差神清合作，皮肤巩膜轻度黄染，胸部发现多个蜘蛛痣，心、肺（-），腹软，稍隆起，全腹无压痛，肝脾触诊不满意。移动性浊音（＋），肠鸣3次／min。双下肢轻度凹陷性水肿。实验室检查：肝功ALB22．6g／L，TB51．9μmol／L，DB23．5μmol／L，ALT，AST〈40U／L，TBA53．6μmol/LPA 72mg/L。肾功、电解质、大便正常。