Vav-Cre介导的YFP报告基因系统标记小鼠NK细胞的特异性和效率检测

目的探索Vav-Cre介导的黄色荧光蛋白(YFP)报告基因系统标记小鼠体内自然杀伤(NK)细胞的特异性和效率。方法通过基因型分型筛选ROSA26R-YFP与Vav-Cre小鼠杂交后代中双阳性基因型小鼠,流式细胞术分析免疫器官淋巴结、脾、胸腺以及骨髓细胞的YFP表达效率,通过细胞表面抗体标记淋巴结、脾及骨髓的NK细胞,流式细胞术分析NK细胞群体中YFP阳性细胞百分比。结果 ROSA26R-YFP与Vav-Cre小鼠杂交后代共17只,双阳性基因型小鼠(ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre)11只;流式细胞术分析淋巴结、脾、胸腺、骨髓细胞中YFP阳性细胞的百分比(%)分别为73.87±1.51、56.07±1.47、86.17±1.74、53.60±3.56,阴性对照组相应器官分别为0.27±0.01、1.33±0.91、0.11±0.01,0.29±0.03,差异有统计学意义(均P<0.01),两种类型小鼠非免疫器官肾中均无明显YFP表达(双阳性鼠0.72%±0.43%,对照鼠0.92%±0.27%,P>0.05);淋巴结、脾和骨髓中NK细胞YFP阳性百分比(%)76.94±0.84、81.66±1.18、88.92±0.77,与阴性对照组比较均明显增高(均P<0.01)。结论 Vav-Cre介导的YFP报告基因系统标记小鼠体内NK细胞具有特异性及高效性。

EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定

目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.

ERT2-Cre诱导的Rosa26R-YFP报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率检测

目的 探索ERT2-Cre诱导的黄色荧光蛋白（YFP）报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率.方法 通过基因型分型的方法,从Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠杂交得到的后代中,筛选出YFP及ERT2-Cre双阳性转基因杂交小鼠;采用免疫磁珠法从双阳性转基因小鼠骨髓细胞中富集c-kit＋造血干祖细胞群进行体外培养,并用不同浓度4-羟基它莫西芬（OHT）作用不同时间以诱导YFP表达;流式细胞术检测c-kit＋造血干祖细胞中YFP的表达量.结果 Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠的杂交后代共9只,采用基因型分型方法筛选出双阳性转基因小鼠5只;体外培养的c-kit＋细胞部分形态发生变化,提示存在细胞分化;流式细胞术检测到c-kit＋细胞中YFP表达量可达13.7％.结论 YFP报告基因系统在OHT诱导的ERT2-Cre作用下,能有效标记小鼠造血干祖细胞.