黄瓜遗传转化体系优化的研究

为了提高农杆菌介导的黄瓜遗传转化效率,以亚洲生态型长春密刺、欧洲生态型Poinset76和Marketmore763种黄瓜为材料,筛选了适合遗传转化最佳的基因型,并通过改变培养基固化剂、添加抗氧化剂和有机添加物的方式对遗传转化体系进行优化。结果发现,3种基因型黄瓜中,长春密刺的抗性芽诱导分化表现最佳,而Poinset76和Marketmore76稍差;在脱乙酰吉兰糖胶为固化剂的培养基上,3种基因型的抗性芽诱导率比以琼脂粉为固化剂的培养基诱导率分别高28.21,19.71,15.39个百分点;共培养基中添加50 mg/L抗氧化剂α-硫辛酸时,长春密刺抗性芽诱导率最高达66.67%,平均芽分化数最高达1.32;在选择培养基中添加1.5 g/L的有机添加物水解酪蛋白,长春密刺抗性芽诱导率和平均芽分化数最高,分别为67.15%和1.42。此外,在前人建立的农杆菌介导的遗传转化体系的基础上,得到了以长春密刺为遗传转化的最适基因型,脱乙酰吉兰糖胶为培养基固化剂,共培养基中添加50 mg/Lα-硫辛酸或选择培养基中添加1.5 g/L水解酪蛋白的优化遗传转化体系,极显著提高了外植体抗性芽诱导率和平均芽分化数,推动了黄瓜转基因进程。

黄瓜T-DNA插入突变体库的构建

[目的]为了进一步研究黄瓜基因的功能,本文构建了黄瓜T-DNA插入突变体库。[方法]以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,将T-DNA插入突变载体pROK2后转化黄瓜;通过筛选压力梯度试验,确定遗传转化体系最适合的卡那霉素(Kan)筛选浓度;使用PCR检测和斑点杂交方法鉴定T0和T1代转化植株;以‘长春密刺’植株为对照,统计T1代植株表型。[结果]确定100 mg·L-1为最适合的Kan抗性芽筛选浓度。T0代植株PCR检测结果初步证明,pROK2成功整合到14S1和14S2两个T0代株系基因组中。14S1自交后获得55个T1代单株,对其进行PCR检测,发现其中12个单株均扩增出了35S和NPT-Ⅱ片段。以Dig标记的35S和NPT-Ⅱ为探针,对这12个单株及随机从剩余T1代中选取的11个单株进行斑点杂交检测,得到了2个含有35S和NPT-Ⅱ杂交信号的单株:14S1-27和14S1-34。性状调查统计显示:T1代植株在生长各阶段相对于野生型无明显突变表型。[结论]pROK2重组质粒成功整合到了14S1株系的基因组中。对14S1自交后代的PCR检测和斑点杂交检测结果进一步证明了14S1为转化植株,确定14S1为插入突变体。结合T-DNA插入位点鉴定技术可进一步开展相关基因分离及功能研究工作。

过表达钙调素类似蛋白基因CML25-like诱导黄瓜单性结实的研究

[目的]钙调素类似蛋白(calmodulin-like protein,CML)是一类含有EF-hand结构域的钙受体蛋白,与植物细胞的分裂及形态建成密切相关。本文基于前期克隆的一个黄瓜果实特异性表达基因CML25-like,研究其调控单性结实的机制。[方法]采用RT-qPCR方法研究CML25-like表达的时空特点;构建植物表达载体pLP100-35S-CML25-like,利用农杆菌介导子叶节法转化黄瓜自交系CCMC,并研究转基因植株的表达特点;观察转基因植株的表型,采用RT-qPCR方法检测其坐果期激素相关基因的表达变化。[结果]CML25-like在黄瓜幼叶和雌花中表达量最高,在雄花中表达量最低,而且CML25-like在果实发育过程中上调表达,在果实败育过程中下调表达;性状统计发现过表达CML25-like植株的单性结实率最高可达到98.25%,比对照CCMC提高了86%,而且单性结实果实与对照授粉果实的长度和横径均无明显差异。RT-qPCR检测结果显示,在转基因植株坐果期22个激素相关基因中有16个显著上调表达。[结论]CML25-like基因的活跃表达与果实发育密切相关,而且CML25-like能够诱导黄瓜单性结实,促进果实膨大,推测CML25-like通过上调弱单性结实黄瓜子房中激素相关基因表达而诱导单性结实。

黄瓜扩张素蛋白基因CsEXPb1的克隆及表达分析

基于黄瓜果实转录组学研究,筛选并克隆了一个扩张素蛋白(β-expansin)基因Cs EXPb1。蛋白序列同源比对发现Cs EXPb1蛋白是一类钙调素类似蛋白(Calmodulin-like Protein,CML),与甜瓜、草莓及番茄扩张素蛋白基因具有较高的相似性;Ex Pasy分析发现Cs EXPb1为亲水性蛋白,亚细胞定位分析证明该蛋白广泛分布在细胞质以及细胞核结构中;q RT-PCR分析发现Cs EXPb1无论是在授粉坐果还是单性结实坐果过程中皆上调表达,而在不授粉败育的果实中下调表达;q RT-PCR也表明Cs EXPb1的表达受到生长素、细胞分裂素和赤霉素等单性结实诱导激素的正向调控,推测Cs EXPb1与黄瓜坐果有关,可能参与了激素诱导的单性结实过程。