肺炎链球菌体内诱导基因的筛选及初步鉴定

为筛选鉴定肺炎链球菌宿主体内诱导的基因，寻找潜在的抗生素作用靶点和疫苗候选者，应用体内表达技术，以肺炎链球菌荚膜合成的关键基因galU作为体内报告基因，利用其缺陷体不能合成荚膜多糖，从而不能在宿主体内存活的特点，筛选鉴定肺炎链球菌体内诱导基因。首先，把肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段（200～500bp）克隆到含有体内、体外双重报告基因（galU—lacZ）的报告载体pEVP3-galU的BlgⅡ位点，将获得的质粒库转化肺炎链球菌galU缺陷菌株，得到肺炎链球菌体内启动子诱捕文库，将此文库去感染BALB／c小鼠，经过两轮体内筛选，在涂布有X-gal的TSA血清平板上得到了165个白色菌落，对插入的随机片段进行测序及生物信息学分析，共证实15个不同的体内诱导基因片段，8个为单独的ORF，7个为含有多个ORFs的操纵子结构，它们分别参与细菌在宿主体内的定植与粘附、能量代谢、物质转运、转录调节、DNA复制与重组、细胞壁合成等，另外还包括功能不明的假想蛋白。其中部分ORFs可能与细菌毒力相关，可以作为候选疫苗和药物的靶标。

肺炎链球菌体内启动子诱捕文库的构建与初步分析

构建肺炎链球菌体内启动子诱捕文库（promoter-trap library），用于筛选肺炎链球菌体内诱导的基因。以穿梭质粒pEVP3为骨架，将无启动子的galU基因作为体内报告基因定向克隆到pEVP3上，与无启动子的体外报告基因lacZ基因融合，构建用于筛选体内诱导基因的载体pEVP3-galU；再把肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段（200-500bp）克隆到此载体galU基因上游的BglⅡ位点，构建了启动子诱捕文库，并转化肺炎链球菌galU缺陷菌株，获得相应的菌株库。文库大约覆盖基因组全长的5倍，插入率达到90％以上，保持了较高的复杂性。对得到的约450000个肺炎链球菌转化子进行体内、外初步分析，那些从小鼠体内分离出的细菌，并在X-gal平板上为白色的菌落表明galU报告基因上游含仅在体内表达的启动子，提示所构建的启动子诱捕文库可用于筛选肺炎链球菌的体内诱导基因。

重庆地区1205例男性不育患者精液分析

目的对重庆地区男性不育患者精液参数进行回顾性分析,为评价男性生育力提供依据。方法采用计算机辅助精子分析系统(computer-aided sperm analysis,CASA)对2009年3月至2009年10月到重庆医科大学附属第一医院辅助生殖中心就诊的1205例男性不育患者的精液参照WHO标准进行常规分析,精子形态采用改良巴氏染色法。对所获得的参数,如精液量、pH、密度、存活率、活力、形态等进行分析。结果男性不育患者中精子密度正常者占80.2%,无精症占7.1%,少精症占12.7%。弱精症占男性不育患者的89.1%。畸形精子症占男性不育患者的6.3%。结论采用计算机辅助精子分析系统结合精子形态的改良巴氏染色,对不育患者精液的密度、活力及形态等参数进行分析,可为临床上男性不育症的诊断和治疗提供有力的参考依据。

肺炎链球菌致病机理的最新研究进展

肺炎链球菌致病过程包括粘附 ,炎症反应 ,细菌产物的细胞毒作用。阻止肺炎链球菌粘附到宿主细胞受体和定植在粘膜表面 ,是预防其感染的最有效的途径。综述了肺炎链球菌粘附过程的最新研究进展和肺炎链球菌毒力因子及其可能的致病机理 ,对研制新一代疫苗 ,预防和治疗肺炎链球菌感染有重要意义。

肺炎链球菌转化模型的建立与优化

建立肺炎链球菌转化模型，优化转化体系，提高转化率，以便于进一步研究其致病的分子机制。制备肺炎链球菌感受态。首先在不同菌密度下转化外源DNA，计数抗生素筛选平板上的转化菌落，比较其转化率，确定转化的最适菌密度；然后在此菌密度下比较CSP诱导不同时相的转化率，同时用RT-PCR检测感受态调控基因comE的表这。对所用血清3型菌株而言转化的最适菌密度在OD550=0．09～0．10之间；CSP-2诱导10min后转化率最高，可达（15．6±3）％；comE的表达也在CSP-2诱导10min后达到最高。在实验室条件下。肺炎链球菌转化受多种因素的影响，必需控制好各种因素。选择最优条件才能获得稳定、高效的转化。

肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究

目的 :galU基因是肺炎链球菌荚膜合成的关键基因 ,构建该基因的缺失突变体 ,获得肺炎链球菌荚膜缺陷菌株 ,研究其生物学功能 ,并为肺炎链球菌功能基因组研究提供实验菌株和技术平台 .方法 :采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH PCR)方法制备中间为红霉素耐药基因 (erm ) ,两侧为galU基因上、下游同源序列的连接片段 ,并将此片段转化入肺炎链球菌 ,在含红霉素的血平板上筛选出缺陷菌株 .用PCR鉴定缺陷菌株 ,小鼠实验研究其毒力 .结果 :PCR结果显示 galU基因完全被erm基因所替代 ,小鼠毒力实验表明缺陷菌株毒力显著下降 .结论 :galU缺失突变体在小鼠体内不能形成荚膜导致其难以在小鼠体内存活 ,可作为筛选肺炎链球菌体内诱导启动子的宿主菌 .用LFH PCR作基因突变 ,可完全替代靶基因 ,简便、快速 ,是肺炎链球菌功能基因组研究的一种有效的方法 .

用宫颈脱落细胞AgNORs银染面积早期筛查宫颈癌

目的 寻求一种新的早期筛查宫颈癌的方法。方法 应用银染法结合计算机图像分析软件测定 2 0例正常人 ,12例CINⅠ ,11例CINⅡ ,12例CINⅢ和 2 4例宫颈鳞癌患者宫颈脱落细胞中AgNORs银染面积 ;并用PCR技术检测HPV、HPV16感染情况。结果 CINⅠ到宫颈鳞癌各组AgNORs银染面积逐渐增加 ,与正常对照组比较均有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,CIN各组间的差异也有显著性 (P <0 .0 5 ) ,CINⅢ和鳞癌组无差异。CINⅠ到宫颈鳞癌各组HPV和HPV16感染率逐渐上升 ,AgNORs银染面积增加与HPV感染无显著相关 (r=0 .74 9,P >0 .0 5 ) ,但与高危型别 (HPV16 )感染显著相关 (r=0 .92 9,P <0 .0 5 )。结论 宫颈脱落细胞AgNORs银染面积测定可能成为一种适于筛选宫颈癌高危人群的简便方法。由于AgNORs银染面积增加仅与高危HPV感染有关 。

宫颈癌脱落细胞核仁形成区嗜银蛋白定量研究

目的对宫颈癌细胞核仁形成区嗜银蛋白(AgNORs)进行定量研究,探讨脱落细胞AgNORs在宫颈癌诊断中的价值。方法应用银染法结合计算机图像分析软件测定22例正常人,34例宫颈癌宫颈脱落细胞及相应石蜡切片中AgNORs银染面积。结果宫颈癌患者宫颈脱落细胞核仁银染面积与细胞核面积的比值(I/S%)为9.64±1.22%,与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.05),与石蜡切片染色结果一致(10.12±1.65%)。结论宫颈脱落细胞AgNORs与细胞增殖活性有关,对宫颈癌的诊断有一定的临床应用价值。

体内病原菌和基因表达技术应用进展

尽管体外分析对人们理解病原菌致病机制有很大的帮助,但它不能完全模拟病原菌所面临的体内复杂环境,限制了其应用.由于病原菌在宿主体内表达的基因在致病过程中起关键作用,为了更好地阐明病原体在体内的致病过程,有必要分析鉴定在感染过程中特异表达的基因,因此体内表达技术(IVET)应运而生.本文简要综述了IVET的基本原理,不同的报告系统及各自的优、缺点.

早孕妇女血清hCG、hPL与流产结局的关系

目的探讨血清人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘生乳素(hPL)与早孕流产结局的关系。方法选择2010年1～12月该院门诊早孕有先兆流产症状孕妇65例,其中保胎成功者34例为保胎成功组,保胎失败31例为保胎失败组,正常早孕46例为正常妊娠组,观察不同孕周及各组之间hCG、hPL的变化。结果保胎成功组和保胎失败组孕5周时,hCG、hPL均明显低于正常妊娠组(P<0.01);保胎成功组和正常妊娠组随孕周增加,hCG明显增高;保胎失败组,随孕周增加hCG、hPL明显低于正常妊娠组和保胎成功组(P<0.01)。结论动态监测hCG、hPL的变化,可及早预测先兆流产的胚胎之预后。

家蝇抗菌肽的免疫诱导及抗菌活性研究

目的诱导家蝇产生抗菌活性肽,鉴定其抗菌活性。方法家蝇经针刺损伤感染大肠埃希菌,免疫诱导24h后制成组织匀浆,经低温盐析、超速离心、Sephadex G50层析、RP-HPLC等技术分离纯化抗菌肽。K-B法和稀释法测定抗菌活性。结果家蝇体内含有抗菌活性成分,家蝇经损伤免疫诱导后分泌抗菌肽的量明显增加,经分离纯化得到了一个色谱纯的抗菌活性肽。该抗菌肽对标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)均有抗菌活性,其MIC分别为2.4μmol/L、3.6μmol/L和4.8μmol/L。结论免疫诱导可促进家蝇抗菌肽的分泌,分泌的抗菌肽有广谱抗菌活性,对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有抑制作用。

400例产后出血患者的危险因素分析及其对应防治方法的临床研究

目的探讨影响剖宫产术后出血的危险因素及研究其对应的防治方法。方法对400例产后出血患者的临床资料进行回顾性分析,记录患者出血原因、分娩方式、分娩史、妊娠并发症等基本资料,进行统计学分析。结果产后出血原因对比中,子宫收缩乏力占74.5%(χ2=249.4,P<0.05);分娩方式对比中,剖宫产占64.5%(χ2=11.1,P<0.05);分娩史对比中,初产占77.0%(χ2=37.7,P<0.05);妊娠并发症对比中,有妊娠并发症占80.0%(χ2=46.8,P<0.05),其余项差异无统计学意义(P>0.05)。结论子宫收缩乏力、剖宫产、初产、有妊娠并发症为影响产后出血的独立危险因素,因此可据情处理。

结核感染T细胞斑点试验及结核抗体在肺外结核病诊断中的临床意义

目的探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)及抗结核抗体(38kD-IgG)试验在肺外结核病诊断中的临床价值。方法分析入院疑患肺外结核治疗的患者68例,其中确诊结核47例,非结核患者21例。用上述两种方法分别检测68例患者,并将二者的结果进行比较。结果 T-SPOT.TB试验检测确诊结核病人的阳性率为78.7%(37/47)明显高于用结核抗体法检测确诊结核病人的阳性率59.5%(28/47)(P<0.05)。二者的特异度分别为95.2%和71.4%,T-SPOT.TB检测特异度明显高于结核抗体检测(p<0.05)。结论 T-SPOT.TB检测是诊断肺外结核的快速敏感方法,在肺外结核性疾病诊断中有重要价值,可作为临床结核病的有效辅助诊断手段。

抑制素A及促性腺激素对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的影响

目的:探讨抑制素A(InhibinA,INHA)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟(In vitro maturation,IVM)的影响。方法:从孕马血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG)组(使用PMSG组,16例)及无PMSG组(未使用PMSG组,20例)获得的生殖泡期(Germinal vescle,GV)卵母细胞在不同浓度INH A的培养液中进行体外培养,观察第一极体(The first polar body,PB1)排出和皮质颗粒(Cortical granules,CG)染色情况。结果:PMSG组获卵数为(17.2±2.6)个/只,无PMSG组获卵数为(15.9±1.8)个/只(P>0.05);PMSG组与无PMSG组的PB1率分别为57.7%、50.7%(P>0.05)。PMSG组中INH A200、350ng/ml组的PB1率较对照组高(P<0.05);无PMSG组中各INH A组PB1率与对照组比较无显著差异(P>0.05);结论:INH A和PMSG对体外培养GV期卵母细胞核成熟有促进作用。

血必净对重症肺炎患者的疗效分析

目的考察血必净注射液对重症肺炎患者的治疗作用。方法选择100例医院重症肺炎患者平均随机分为对照组和治疗组(n=50),对照组给予营养支持、机械通气等基础治疗,治疗组在此基础上给予血必净治疗。流式细胞术检测对照组和治疗组治疗前及治疗后的CD4+、CD8+、NK水平、以及酶联免疫吸附法检测白介素-1(IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果相比于对照组,治疗组治疗的患者总有效率高于对照组,有显著性差异(P<0.05);治疗组治疗后IL-1、IL-6、TNF-α水平相比于治疗前和对照组都有明显降低,有显著性差异(P<0.05);与对照组和治疗组治疗前相比较,治疗组治疗后的CD4+/CD8+比值、NK水平都有显著性提高(P<0.05)。结论血必净对于基础治疗后的重症肺炎患者病情有明显改善作用,具有显著的治疗效果。

早孕妇女血清β-绒毛膜促性腺激素、人胎盘生乳素与多胎关系

目的:通过对早孕多胎妇女血清中β-绒毛膜促性腺激素(Beta-human chorionic gonadotropin,β-HCG)、人胎盘生乳素(Human placental lactogen,HPL)的测定,探讨其与多胎的关系。方法:动态监测门诊18例早孕多胎(包括2胎和3胎)妇女血清β-HCG、HPL的变化,随机选取同期本院门诊正常单胎早孕妇女35例作为对照,从孕5周开始,每2周检查1次血清β-HCG、HPL水平,至孕11周,观察相同孕周2组之间β-HCG、HPL的变化。结果:孕5～9周,多胎组血清β-HCG明显高于单胎组,差异有统计学意义(P<0.05);孕11周时,多胎组和单胎血清β-HCG差异无统计学意义(P>0.05);孕5周时,多胎组和单胎组HPL值差异无统计学意义(P>0.05)。孕7～11周,多胎组血HPL明显高于单胎组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:早孕时如β-HCG明显增高,结合HPL升高,应警惕多胎妊娠。

Ghrelin基因在多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞中的表达

目的:探讨Ghrelin基因在卵巢颗粒细胞中的表达及其与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系。方法:选择47例在重庆医科大学辅助生育中心接受体外受精-胚胎移植治疗的不孕妇女,其中PCOS组11例,对照(Non-PCOS)组36例,采用real-time PCR及免疫印迹法分别测定2组妇女卵巢颗粒细胞中Ghrelin m RNA和蛋白的表达水平。结果:PCOS妇女颗粒细胞中Ghrelin m RNA和蛋白的表达均低于Non-PCOS妇女(0.926±0.206 vs.1.137±0.105,t=2.73,P=0.015;0.647±0.052 vs.0.937±0.038,t=7.82,P=0.001)。结论:PCOS妇女卵巢颗粒细胞的Ghrelin m RNA和蛋白表达水平明显低于Non-PCOS妇女,可能与卵泡发育障碍相关。

流式荧光杂交技术和导流杂交基因芯片技术在HPV分型检测中的应用评价

目的对检测人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染分型的流式荧光杂交技术(flexible multi-analyte profiling,xMAP)和导流杂交基因芯片技术(flow-through hybridization and gene chip,HybriMax)进行评估。方法参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)EP12-A2文件推荐方法,通过比较2种检测试剂的C50值,判断其检测灵敏度差异;用xMAP技术检测751例宫颈病变妇女的宫颈脱落细胞标本,判断其临床符合率;用xMAP和HybriMax同时检测535份液基薄层细胞学检测(thinprep cytologic test,TCT)异常标本,比较两种方法检测高危亚型HPV(HR-HPV)结果的一致性。结果 xMAP技术检测HPV的C50小于HybriMax技术C50。HPV感染率随亚临床HPV感染(SPI)、子宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ、CINⅡ、CINⅢ的变化而升高,其差异有统计学意义(χ2=143.15,P<0.01)。两种试剂检测标本HR-HPV结果的kappa值为0.76;两者检出的13种HR-HPV的构成比差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 xMAP技术和HybriMax技术检测HPV结果一致性较好,xMAP技术灵敏度更高,操作更快速方便,适用于HPV感染普查和宫颈疾病高危人群的监控。

经皮附睾和睾丸细针穿刺抽吸术在诊断无精子症中的应用

目的:研究经皮附睾(Percutaneous epididymalsperm aspiration,PESA)和睾丸细针穿刺抽吸术(Testicular sperma spiration,TESA)在无精子症诊断中的应用价值。方法:在诊断为无精子症的患者中,经睾丸体积测定、血清性激素水平、生殖系统B超等检查后,选择符合穿刺条件者168例,用细针于局麻下行PESA或PESA+TESA(PESA/TESA),对抽吸获得组织显微镜下检查。结果:PESA/TESA结果显示,168例中未见精子41例(22.4%)。PESA/TESA联合睾丸体积、血清FSH水平,对无精子症进行诊断符合率为91.3%。结论:PESA/TESA细针操作简单且创伤小,是诊断无精子症的可靠方法。

姜黄素对多囊卵巢综合征模型大鼠血清和卵巢中VEGF表达的影响

目的观察姜黄素对多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠血清和卵巢中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法选用42 d龄未成年雌性大鼠60只,采用脱氢表雄酮联合诺和灵N的方法构建大鼠PCOS的病理模型。将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、姜黄素低剂量组和姜黄素高剂量组。采用ELISA法检测各组大鼠血清中VEGF的表达水平;采用免疫组织化学法检测各组大鼠卵巢组织中VEGF的表达水平;Western blotting法检测VEGF的蛋白水平表达。结果 ELISA法结果显示,PCOS大鼠血清中的VEGF表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);而给予姜黄素腹腔注射后,血清中的VEGF表达较模型对照组均有所降低,且高剂量组的表达低于低剂量组的表达(P<0.05)。免疫组织化学和Western blotting结果显示:VEGF蛋白在模型对照组卵巢中的表达阳性率均高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01),而姜黄素干预后其表达水平均降低,且高剂量组的表达阳性率显著低于低剂量组(P<0.05)。结论姜黄素能够显著降低PCOS大鼠血清和卵巢组织中VEGF的表达,提示其可能对PCOS具有一定的治疗作用。