白念珠菌与生物膜相关的耐药机制

白念珠菌在医疗植入材料上形成生物膜,导致高死亡率感染。成熟的生物膜具有强耐药性,使得生物膜相关感染难以治愈。文章主要从白念珠菌生物膜外排泵基因、细胞外基质以及压力应答等3个方面探讨白念珠菌生物膜的耐药机制,综述该研究方向的最新进展,为白念珠菌的临床防治策略制定提供参考。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在真菌和细菌的研究进展

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases,PPTase)可催化脂肪酸合酶(fatty acid synthases,FAS)、聚酮合成酶(polyketide synthases,PKS)以及非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide syntethases,NRPS)的酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)及肽酰载体蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)等的翻译后修饰反应,将辅酶A(coenzyme A,CoA)上的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到ACP及PCP的保守丝氨酸残基上,从而激发ACP及PCP的活性,由此脂肪酸、聚酮、非核糖体肽得以合成。在大部分真菌及细菌中都存在着PPTase,且其在生物代谢中起到重要的作用。现对其研究进展进行阐述。

真菌细胞外囊泡的研究进展

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种细胞分泌的膜性囊泡。研究表明EVs在细胞生命的许多方面起着重要作用,包括细胞间的通讯、发病机制和癌症进展[1]。然而,EVs在微生物学中的作用却研究较少,EVs在微生物中最先是在革兰氏阴性菌中发现的[2],后续的研究表明它们在革兰氏阳性菌中也普遍存在[3],此后也有研究发现其在病毒致病过程中的作用和机制。目前,关于EVs与真菌感染关系的研究甚少,本综述将介绍EVs在真菌中的相关研究进展。

53株耐碳青霉烯类药物粘质沙雷菌的耐药表型分析

目的研究耐碳青霉烯药物粘质沙雷菌的耐药表型。方法收集南京大学医学院附属鼓楼医院2018年6月~2019年9月临床分离的235株非重复粘质沙雷菌,采用Vitek 2 Compact配套GN13药敏板卡和纸片扩散法进行药物敏感性检测;采用改良碳青霉烯酶灭活试验(mCIM)和EDTA-改良碳青霉烯酶灭活试验(eCIM)对碳青霉烯酶表型进行筛选;采用PCR及测序分析检测碳青霉烯酶基因携带情况。结果235株粘质沙雷菌中检出同时对美罗培南和亚胺培南耐药菌株53株(22.6%)。53株碳青霉烯类耐药菌株中对头孢他啶敏感和中介分别为23株(43.4%)和21株(39.6%),对头孢曲松、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均大于98%,对阿米卡星、复方新诺明的耐药率分别为1.7%和1.6%。mCIM均阳性,eCIM阳性3株。53株耐药菌株中检出blaKPC-2基因51株,检出blaNDM-1基因1株,同时携带blaKPC-2和blaNDM-1基因1株,未检出blaIMI、blaOXA48、blaFOX、blaIMP和blaVIM基因。结论本院耐碳青霉烯粘质沙雷菌检出率较高,blaKPC-2基因是介导本院粘质沙雷菌对碳青霉烯类药物耐药的主要流行基因型。

无绿藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及应用

目的建立无绿藻(Prototheca)PCR ITS1-ITS2基因鉴定分型方法,并通过系统发育树以研究各型别无绿藻菌株间的亲缘关系。方法抽提5株无绿藻临床分离菌株的DNA,通过特异性引物扩增ITS1及ITS2区后,根据该区域核苷酸片段的差异进行基因分型,借助MEGA6.0软件建立系统发育树,并通过SSU rDNA测序加以验证。结果 5株菌株中,1株鉴定为P.zopfii hydrocarbonea,2株鉴定为P.wickerhamii。虽然由于数据库中缺乏P.zopfii portoricensis菌株ITS序列导致1、2号菌株不能被鉴定,但ITS区系统发育树中这两株菌仍被归为P.zopfii中独立的一簇,与SSU rDNA系统发育树相近,证明此分型方法无误。结论 PCR ITS1-ITS2基因分型法可作为一种有效基因分型方法用于鉴定和监测无绿藻感染。

白念珠菌TFP1基因与钙调神经磷酸酶通路的相关性分析

目的构建白念珠菌TFP1基因敲除株,并初步分析白念珠菌TFP1基因与钙调神经磷酸酶通路相关基因的关系。方法通过融合PCR将白念珠菌TFP1基因上下游和营养缺陷筛选标记连接组成基因敲除组件,再运用醋酸锂转染法将一条基因敲除组件转入白念珠菌工程菌SN152,在营养缺陷平板上筛选出TFP1^(+/-)菌株,再运用同样的方法敲除第2条等位基因。采用实时荧光定量PCR的方法检测TFP1^(-/-)菌株、TFP1^(+/-)菌株以及SN152菌株RTA2和CRZ1基因的表达量。结果成功构建白念珠菌TFP1双等位基因敲除株,并且双等位基因敲除株中RTA2和CRZ1基因表达量均下降。结论敲除白念珠菌TFP1基因影响钙调神经磷酸酶通路相关基因RTA2和CRZ1的表达。

血清淀粉样蛋白A在胃癌辅助诊断中的临床应用

目的研究血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)检测在胃癌诊断中的价值。方法收集2018年11月至2019年4月医院收治并经病理确诊的治疗前胃癌患者156例、治疗后胃癌123例,并取慢性浅表性胃炎30例、萎缩性胃炎30例及健康人群105例作为对照,采用乳胶增强免疫比浊法检测血清SAA水平。结果利用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线计算出SAA的最佳临界值为3.67 mg/L,以此作为阳性诊断临界点,其约登指数最大时(33.1%)的灵敏度为39.1%,特异性为93.3%,联合癌胚抗原(carcineoembryonic antigen,CEA)、CA19-9、CA724检测灵敏度则升至44.2%。血清SAA在区别胃癌与慢性浅表性胃炎或慢性萎缩性胃炎时差异有统计学意义(P<0.05);在不同肿瘤位置、TNM分期、分化程度、远处转移情况、肿瘤大小、区域淋巴结转移程度中差异也有统计学意义(P<0.05),而在不同性别、年龄、是否为印戒细胞癌、肿瘤侵润程度中差异无统计学意义(P>0.05);在病情稳定组与病情进展组、病情好转组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论血清SAA检测在治疗前胃癌及早期胃癌诊断的灵敏度上优于CEA、CA19-9、CA724,且SAA与胃癌病理以及治疗后病情关系密切,可用于胃癌筛查诊断、分期评估及病情监测。

白念珠菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2的制备

目的制备白念珠菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2,用于后期荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物。方法以白念珠菌BWP17基因组DNA为模板,用PCR法扩增PPT2 DNA序列,与线性化载体pET43.1a(+)通过同源重组连接,成功构建重组表达质粒pET43.1a(+)/PPT2后转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3),通过IPTG诱导重组蛋白表达,利用超声破碎法抽提蛋白Ppt2后离心收集上清和沉淀,通过SDS-PAGE验证蛋白的可溶性。利用镍柱对蛋白进行纯化,对洗脱馏分透析富集目的蛋白。最后通过Bradford方法测得蛋白含量。结果在大肠埃希菌BL21中获得了白念珠菌蛋白Ppt2的高效表达;抽提蛋白后SDS-PAGE电泳结果显示Ppt2同时存在可溶性形式和包涵体形式,放大摇菌量后收集上清可溶性蛋白经镍柱纯化得到目的蛋白,再次透析富集蛋白Ppt2后利用Bradford方法测得蛋白Ppt2浓度为0.4 mg/mL。结论成功制备了白念珠菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2,为后期利用荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物提供基础。

白念珠菌White-Gray-Opaque表型转换系统的研究进展

白念珠菌是人类常见的条件致病菌,而表型转换是其重要的生物学特性,各个表型在宿主适应、感染、毒力及不同生活阶段发挥着不同作用。White-Gray-Opaque表型转换是白念珠菌的一种新型转换系统,该文从White-Gray-Opaque表型特点、影响表型转换的调控因素、表型与宿主的相互作用等方面综述近年来白念珠菌在该表型系统中的研究进展,希望通过理解其形态调节的机制以寻找感染治疗的新策略。

酵母相和菌丝相白念珠菌感染阴道上皮细胞免疫反应的比较

目的白念珠菌作为一种二相菌,存在酵母相和菌丝相二态,本实验研究这两种不同形态的白念珠菌刺激阴道上皮细胞,比较其引起的免疫应答差异。方法以阴道上皮细胞株VK2/E6E7为模型,分别给予不同浓度的活的白念珠菌和热灭活白念珠菌SC5314(感染指数MOI分别为10、50、100)进行刺激,以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测3 h、6 h、12 h感染组细胞的促炎因子TNF-α和趋化因子IL-8的分泌水平。结果活的白念珠菌在K-SFM细胞培养基中呈菌丝相,热灭活的白念珠菌在K-SFM培养基中呈酵母相。两相感染组分泌IL-8和TNF-α水平与未感染组相比具有显著差异。在各个MOI条件下,菌丝相感染组释放细胞因子mRNA水平均显著高于酵母相;在MOI=10时,菌丝相感染组释放细胞因子的蛋白水平强于酵母相感染组,而随着MOI的增大,结果相反。结论酵母相和菌丝相白念珠菌均能诱发阴道上皮细胞出现显著免疫反应。同时,在MOI=10时,菌丝相白念引起的免疫反应强于酵母相白念。两相感染组免疫反应强度的差异提示两者引起免疫应答的机制可能不同。

体外氟康唑诱导光滑念珠菌和近平滑念珠菌耐药及相关机制研究

目的:研究光滑念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑耐药的易感性及其诱导耐药株的耐药机制。方法 :选取对氟康唑敏感的光滑念珠菌、近平滑念珠菌临床株各1株以及对氟康唑敏感的光滑念珠菌标准株ATCC2001、近平滑念珠菌标准株ATCC22019,利用浓度递增法,在体外用氟康唑诱导使其成为耐药株,采用实时定量PCR检测外排泵相关基因、其转录因子和靶酶编码基因表达,并对光滑念珠菌PDR1转录因子、近平滑念珠菌MRR1转录因子和ERG11基因进行PCR扩增和测序。结果 :光滑念珠菌较近平滑念珠菌更易被氟康唑诱导为耐药株,CDR1的过度表达为其主要的耐药机制,对PDR1转录因子测序后发现了新的突变位点Y932C、V847F。近平滑念珠菌诱导耐药株的MDR1表达显著增加,其MRR1转录因子中亦存在新的突变位点P295S、I799S。结论 :光滑念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑的耐药易感性不同,耐药机制也存在差异。新发现的转录因子突变位点有待验证其功能。

新靶点PPTase抗真菌药物的研究进展

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)可修饰脂肪酸合成酶、聚酮合成酶和非核糖体多肽合成酶复合体中的载体蛋白,使其由无活性形式转变成活性形式,同时它参与脂肪酸、聚酮、非核糖体多肽的合成,因而可作为抗菌药物有效的且颇具研究价值的新靶点。本文由PPTase的分类展开,进而阐述各类别发现的药物,综述该研究领域的最新进展,为新型抗真菌药物的研发提供参考。

抗真菌药物新作用靶点机制的研究进展

条件致病性真菌在过去的几十年中逐渐被认为是人类真菌感染的重要致病菌，尤其对于免疫功能低下的患者，如移植受者、艾滋病患者和癌症患者．由念珠菌属引起的侵袭性感染是现代血流感染的第四大死因。

白念珠菌酰基载体蛋白1的制备

目的 :通过在大肠埃希菌BL21中表达白念珠菌酰基载体蛋白1(acyl carrier protein 1,Acp1),以制备高纯度的目的蛋白。方法:采用PCR扩增目的基因ACP1后,在序列的C端拼接上6xHis tag及终止子,拼接完成后连接构建到质粒中,成为原核表达载体pET30a-ACP1,转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达。收集表达产物后通过镍离子螯合柱纯化,最终利用考马斯亮蓝Bradford法测得目的蛋白含量。结果:白念珠菌酰基载体蛋白Acp1在大肠埃希菌BL21中高效表达;抽提纯化蛋白后行蛋白电泳检测,结果显示,在还原条件下Acp1一直存在2条相对分子质量为17 000的条带。经还原和非还原电泳及蛋白印迹法检测,结果显示该蛋白在非还原状态下有聚集。利用Bradford方法测得蛋白Acp1浓度为2.68 mg/mL。结论:成功制备了白念珠菌酰基载体蛋白Acp1,为后期利用荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物提供基础。