通用型植物GFP标签蛋白表达载体的构建和蛋白质的细胞内定位研究

目的构建通用型植物GFP标签蛋白表达载体,研究蛋白质的细胞内定位对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义。方法构建2种GFP标签蛋白质表达载体,分别在GFP的N和C端预留克隆位点,以克隆目的基因。利用该基因克隆载体,分别克隆内切酶Fok I的切割结构域与MS2噬菌体外壳蛋白MCP的串联蛋白(Fok I:MCP:Fok I,FMF)至GFP的N和C端,得到FMF与GFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP,其中FMF的N端带有细胞核定位信号。利用农杆菌介导植物瞬时表达侵染本氏烟草和洋葱表皮细胞,观察GFP荧光表达情况。结果成功构建了2种融合了目的基因和GFP的表达载体p ER35GFP-FMF和p ER35FMF-GFP。激光共聚焦结果显示侵染了只含GFP载体的农杆菌的烟草细胞,可在细胞核和细胞质中检测到GFP的绿色荧光,而侵染了含核定位信号FMF:GFP和GFP:FMF 2种融合蛋白载体的农杆菌的烟草细胞,只在细胞核中观察到绿色荧光。结论该载体系统可运用于研究蛋白质在植物细胞中的亚细胞定位,具有克隆简单、高效和通用性的特点。

ADAM17-shRNA对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及机制

目的探讨解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)-短发夹RNA(shRNA)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其可能机制。方法将MCF-7细胞分为无义序列组、对照组、转染组。针对ADAM17基因设计合成4个特异性ADAM17-shRNA(ADAM17-shRNA-1219、ADAM17-shRNA-1508、ADAM17-shRNA-1134、ADAM17-shRNA-297),采用电穿孔法转染MCF-7细胞:无义序列组转染无义序列ADAM17-sh NC,转染组分别转染ADAM17-shRNA序列ADAM17-shRNA-1219、ADAM17-shRNA-1508、ADAM17-shRNA-1134、ADAM17-shRNA-297。对照组加入空白PBS,分别采用利用Real-time PCR、Western blotting法、i CELLigence法及流式细胞仪检测各组ADAM17 mRNA表达水平、ADAM17蛋白表达情况、细胞生长曲线和增殖活性及细胞周期变化。结果 4个ADAM17-shRNA序列对MCF-7细胞的ADAM17基因表达均有抑制作用,以shRNA1219载体的抑制效率最高,与对照组和无义序列组比较差异均具有统计学意义(P均<0.05);转染组ADAM17 mRNA及蛋白的表达水平明显低于无义序列组和对照组(P均<0.05);转染组细胞增殖活性和细胞生长速度较无义序列组和对照组均显著降低(P均<0.05);转染组细胞进入S期和G2/M期的比例降低,绝大多数细胞停留在G0/G1期,与对照组、无义序列组比较差异显著(P均<0.05)。结论 ADAM17-shRNA可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性,机制与其对ADAM17基因具有沉默作用有关。

缺氧条件下沉默解聚素-金属蛋白酶17基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的探讨在缺氧条件下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)基因的短发夹RNA(sh RNA)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用机制。方法针对ADAM17基因设计具有特异性ADAM17-sh RNA,经电穿孔转染MCF-7细胞。依据细胞培养条件(常氧和缺氧)和细胞转染因素(空白PBS、转染无义序列ADAM17-sh NC、转染ADAM17-sh RNA),实验分为常氧对照组、常氧sh NC组、常氧sh RNA组、缺氧对照组、缺氧sh NC组和缺氧sh RNA组。通过充入1%氧O_2、5%二氧化碳CO2和94%氮N2的混合气体培养箱模拟缺氧环境,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)、i CELLigence系统、流式细胞仪检测MCF-7细胞的ADAM1基因的表达水平、细胞生长曲线、增殖活性和细胞周期。结果靶向针对ADAM17基因的ADAM17-sh RNA在缺氧条件下可以有效沉默人乳腺癌MCF-7细胞ADAM17基因的表达(缺氧sh RNA组2^(-△△CT)=0.55±0.16)。从而导致MCF-7细胞生长速度减慢,细胞增殖能力降低,细胞周期延缓。结论 ADAM17sh RNA和缺氧存在协同作用,共同抑制肿瘤细胞的增殖。

ADAM17-shRNA对MCF-7乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用研究

目的观察转染解聚素-金属蛋白酶17-短发夹RNA(ADAM17-sh RNA)的MCF-7乳腺癌细胞在裸鼠体内的生长效果并探索其作用机制。方法将30只裸鼠随机分为转染组(接种转染ADAM17-sh RNA的MCF-7乳腺癌细胞)、空载体组(接种转染sh NC的MCF-7乳腺癌细胞)及对照组(接种正常MCF-7细胞)。分别在各组裸鼠右侧鼷部皮下种植细胞悬液0.2 ml/只,观察各组荷瘤裸鼠的生长状态、饮食及体重变化。第28天处死裸鼠并取出移植瘤。采用HE染色观察组织学形态;Western blot检测肿瘤局部ADAM17、磷酸化表皮细胞生长因子受体(p-EGFR)、表皮细胞生长因子受体(EGFR)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)及细胞外调节蛋白激酶(ERK)的表达。结果对照组、空载体组及转染组移植瘤最终体积分别为(639.821±15.429)、(643.350±15.543)和(240.233±10.536)mm3,3组不同时间点瘤体体积比较有差异(P<0.05);不同组别瘤体体积比较有差异(P<0.05)。HE染色结果显示,移植瘤组织呈乳腺浸润性导管癌特征,对照组与空载体组无明显差异,转染组较对照组、空载体组坏死多。转染组肿瘤组织中ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK及p-ERK的蛋白表达水平低于对照组和空载体组(P<0.05)。结论 ADAM17-sh RNA可有效抑制MCF-7乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长。EGFR-PI3K-Akt和EGFR-MEK-ERK信号传导通路参与ADAM17-sh RNA的抑制作用。

缺氧对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的研究缺氧对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,探讨缺氧与癌细胞增殖及凋亡的关系。方法以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,分为常氧组、缺氧12 h组、缺氧24 h组、缺氧48 h组,各缺氧组通过含1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气的三气水套式培养箱来模拟肿瘤缺氧微环境。采用iC ELLigence系统检测细胞的增殖活性并绘制细胞生长曲线;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果 iC ELLigence系统测定显示:在初始缺氧(12 h)细胞出现快速增殖的现象;随着缺氧时间的逐步延长约24 h后,细胞增殖明显受到抑制。MTT法检测表明:各缺氧组细胞的增殖能力显著低于常氧组,差异有统计学意义(P<0.05)。缺氧24 h组细胞较缺氧12 h组仍有增殖,但抑制率随着时间的延长而增加。流式细胞仪检测细胞周期显示:细胞随着缺氧时间的延长,S期细胞比例下降,G0/G1期明显阻滞,长时间的缺氧可抑制细胞增殖。细胞凋亡率显示:各缺氧组细胞的凋亡率与常氧组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论人乳腺癌MCF-7细胞可在缺氧一定时间内生长,但随着缺氧时间的延长,缺氧可抑制细胞的增殖,同时缺氧可诱导细胞凋亡率的增加。

利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因

目的探讨DNA洗牌技术(DNA shuffling)对蛋白质组学和代谢组学等研究的意义。方法利用DNA洗牌技术一次性克隆多个基因片段到表达载体,并同时突变基因内部的2个氨基酸位点,PCR、酶切、测序检测构建表达载体的准确性。结果成功地一次性克隆了3个编码小RNA的串联短片段MSb1、MSb2、MSb3以及3个蛋白编码基因Fok I、MS2、Fok I,并一次性将PLRV-P0基因内部2个编码色氨酸(W)的密码子TGG突变为编码丙氨酸(A)的GCG密码子。结论 DNA洗牌技术可应用于基因组学、多基因功能鉴定、融合基因表达和一次性构建基因内部多个点突变的研究,具有精确、快速和高效的特点。

shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的利用shRNA干扰沉默人乳腺癌细胞MCF-7的解聚素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17,ADAM17)基因,观察其对细胞增殖的影响。方法针对ADAM17基因设计合成具有特异性的ADAM17-shRNA,经脂质体Lipofectamine TM 2000转染MCF-7细胞。实验设对照组(空白PBS)、干扰组(转染干扰无义序列ADAM17-sh NC)、实验组(转染ADAM17-shRNA),采用Realtime PCR检测各组细胞ADAM17 mRNA的表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果实验组ADAM17 mRNA的相对表达量显著低于对照组和干扰组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组的MCF-7细胞增殖活性较其他两组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);实验组的MCF-7细胞进入S期(23.60±1.09)%和G_2/M期(6.30±0.82)%的比例降低,绝大多数细胞停留在G_0/G_1期(65.17±1.35)%,细胞周期延缓,与对照组、干扰组相比较差异具有显著性意义(P<0.05)。结论 ADAM17-shRNA对人乳腺癌细胞MCF-7的ADAM17基因具有沉默作用,从而抑制MCF-7细胞的增殖活性,延缓细胞周期进展。

植物中指导RNA偶联转录调控因子抑制基因表达研究

本研究建立了一种简单、精确和高效的新型抑制植物基因表达的技术体系。将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、指导RNA(guide RNA,g RNA)和编码转录抑制因子与噬菌体外壳融合蛋白的三种基因构建到植物表达载体中。利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术侵染本氏烟草。研究显示gfp基因在烟草叶片中的表达受到显著抑制,抑制率达到36.2%。此系统可运用于对其他基因进行基因调控,由于只需要改变g RNA,而其他组成原件保持不变,因此该技术具有操作简单及广泛的适应性等特点。为在植物基因组中精确抑制基因表达提供了有效的工具。

ADAM17-shRNA在缺氧条件下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的研究在缺氧环境下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)的短发夹状RNA(shRNA)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法针对ADAM17设计4个特异性的ADAM17-shRNA,经电穿孔法转染MCF-7细胞。缺氧条件下培养细胞。试验分为:对照组(空白磷酸盐缓冲液)、无义序列组(转染无义序列ADAM17-shRNA)和shRNA转染组(转染ADAM17-shRNA,选择沉默ADAM17基因效率最高的shRNA用于后续试验)。分别采用实时荧光定量PCR、iCELLigence、流式细胞仪检测细胞ADAM17mRNA的表达水平、细胞增殖活性和细胞周期变化。结果 4个shRNA转染组对MCF-7细胞的ADAM17基因表达均有沉默作用,与对照组及无义序列组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),尤以shRNA1219抑制率最高(F=5.11,P<0.01)。shRNA转染组的细胞生长速度和增殖活性较对照组和无义序列组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。shRNA转染组的绝大多数细胞停留在G0/G1期(73.35±2.45),与对照组(62.56±2.35)、无义序列组(62.68±1.20)相比较,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期进展明显延缓。结论 ADAM17-shRNA在缺氧条件下抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖。