LRH-PE40重组毒素的高效表达及其特异性细胞毒性

将肿瘤特异性抗体、细胞因子和激素等导向物质与毒性分子如动植物毒素、放化疗药物、细菌毒素等用化学方法偶联起来或用基因融合的方法将各自的基因连接起来表达融合蛋白,制成具有特异靶向特性及细胞毒性作用的导向药物,即所谓“生物导弹”,可以选择性地杀伤相应的抗原相关细胞或受体相关细胞,对其他无关细胞则较少或无影响。这项技术在肿瘤治疗、器官移植、自体免疫病和慢性感染等疾病的治疗上,显示出广阔的前景。

禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因PCA_（10）的高效表达及其免疫原性

以ＰｓｔＩ酶切含禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因片段ＰＣＡ１０的重组质粒ｒＰＣＡ１０，收集基因片段ＰＣＡ１０，经修饰后依次连接到系列高效表达载体ＰＥＶ—Ｖｒｆ１～３的ＢａｍＨＩ切点上，转化至Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ）中。经快速检测，这３种载体的重组子中均有ＰＣＡ１０插入。以间接ＥＬＩｓＡ检测重组子转化菌，只有ＰＥＶ—Ｖｒ１３载体的重组子转化菌与禽巴氏杆菌保护性荚膜抗原（ＰＣＡ）抗血清呈阳性反应，且ＯＤ值为原克隆菌株ｒＰＣＡ１０的３倍，初步证明ＰＣ１０已克隆至高效表达载体ＰＥＶ—Ｖｒｆ３上，而且读码框架正确。用ＥＬＩｓＡ阳性表达克隆株ＰｃＡ７１—Ｖｒｆ３免疫小鼠和鸡，均达到７０％的保护率。

促黄体激素释放激素在大肠杆菌中的表达

促黄体激素释放激素(LRH)是动物下丘脑分泌的一种十肽,分子量为1180,通过调节脑垂体分泌LH和FSH以及直接作用于性腺发挥生理作用,在控制机体生长发育和性周期活动中具有重要作用。在畜牧业生产上,促黄体激素释放激素能有效诱导和加速排卵,促进发情,提高动物繁殖率,能有效治疗卵巢囊肿。目前生产普遍使用化学合成的LRH类似物,但成本高。如果能人工表达LRH。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析

将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列，并证明其具有正确的阅读框架。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

对含有产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）α毒素基因的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１），通过培养性状观察和小鼠接种试验，证明这２株重组菌株均无致病性。随后对这２株重组菌株的表达产物进行了研究，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导３～４ｈ后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白３３．２１％，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白２７．２５％，其相对分子质量约３７５００；经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物可被α毒素抗血清识别。包涵体粗提物的免疫攻毒试验结果表明，以１倍致死量攻击的免疫小鼠可获得１００％（３６／３６）的保护，以２倍致死量攻击的免疫小鼠可获得９４．２８％（３３／３５）的保护，从而说明表达产物具有良好的免疫原性。

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭，本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）结合亚单位（Ⅰ区）和部分跨膜亚单位（Ⅱ区）编码３０９个氨基酸的约１０００ｂｐ的基因片段，以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达Ｔ７启动子下游，构建了高效表达质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ。转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭ１７４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，均表达了外源目的基因蛋白，其中ＢＬ２１（ＤＥ３）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ的表达量明显高于其他宿主菌。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，外源蛋白分子量约３４０００，与ＰＥＡⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符，命名为ＰＥ３４。凝胶薄层扫描显示，ＰＥ３４含量占菌体蛋白总量的５６％。

人表皮生长因子-PE40重组毒素的构建

用ＰＣＲ方法扩增人表皮生长因子（ＥＧＦ）片段，并将其与绿脓杆菌外毒素（ＰＥ４０）片段分别插入质粒ｐＥＴ－１７ｂ中，经酶切分析和ＰＣＲ检测证明成功地构建了表达质粒ｐＥＧＦ４０，旨在表达一种对癌细胞有特异杀伤作用的融合蛋白。

含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化

将表达含绿脓杆菌外毒素（ＰＥＡ）受体结合区基因的质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达了含ＰＥＡ受体结合区的重组蛋白（称ＰＥ３４）。ＰＥ３４主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中，用溶菌酶－脱氧胆酸钠法结合超声波裂解法破碎细菌，离心制备包涵体。用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包涵体后，包涵体纯度可达７５％，在８ｍｏｌ／Ｌ脲存在条件下，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶滤过，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化，获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１条带的ＰＥ３４，纯度达９５．８％，得率为２４．５％。

LHRH-PE40的免疫原性及其抗体对细胞毒作用的影响

目的观察连续静脉注射重组毒素LHRH-PE40所引起的家兔抗LHRH-PE40抗体产生的规律以及该抗体对细胞毒作用的影响。方法将家兔分为3组,第1组隔日连续静脉注射LHRHPE40,第2组用弗氏佐剂乳化的LHRHPE40皮下注射为阳性对照组,第3组静脉注射人血白蛋白为阴性对照组。用ELISA检测血清中的抗体水平,XTT检测LHRH-PE40与血清中和后对Hela细胞的细胞毒作用。结果抗LHRHPE40抗体水平随静脉注射时间的延长而升高,8d可以检测到抗LHRH-PE40抗体,在24d基本达到最高水平。血清中和后LHRHPE40对Hela细胞的半数抑制量较阴性血清提高1～2倍,而阳性血清较阴性血清提高14倍。结论连续静脉注射LHRH-PE40产生较低水平的抗体,这种抗体未造成LHRHPE40对Hela细胞半数抑制量产生严重影响,这为临床连续使用LHRH-PE40提供了依据。

IL-10_(23-57)-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b(+)和pet28a(+)构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b(+)的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a(+)的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.

吉林省黄牛“猝死症”的病因学研究

１９９４年以来，对吉林省黄牛“猝死症”的病因进行了多方面的研究，包括细菌学检验、病毒学检验、人工感染试验、毒物检验、牛毛硒元素分析及病尸病理形态学观察。结果表明，Ａ型魏氏梭菌是主要病原菌，其他细菌有协同作用；牛冠状病毒或粘膜病病毒感染。

一种稳定、灵敏且适用于ELISA的四甲基联苯胺底物

目的评价一种适用于酶联免疫吸附试验(ELISA)的即用型自制四甲基联苯胺(TMB)底物的特性。方法比较1-Step Turbo TMB底物、A/B两组分混合物底物和自制底物与不同稀释度酶标抗体的反应性及其对包被抗体的检测敏感性,对1-Step Turbo TMB底物和自制底物进行稳定性比较。结果 3种底物的吸光度(A)值均随着酶标抗体稀释度的增大而显著下降;当酶标抗体稀释度相同时,自制底物的A值显著高于另外2种底物(P<0.05);在直接ELISA条件下,自制底物对包被抗体的检测敏感性可达15.63 ng/mL;自制底物37℃贮存60 d后的A值仍高于1-Step Turbo TMB底物37℃贮存5 d的A值。结论该即用型自制TMB底物在检测敏感性及稳定性上优于1-Step Turbo TMB底物。

K_99和ST_1双价保护性抗原基因重组菌株的表达及其免疫原性研究

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST_1)是引起幼畜腹泻的重要毒力因子之一,其结构基因编码19个氨基酸,无免疫原性。作者以pSLM_(004)工程菌株为始发菌株,亚克隆ST_1基因,并将ST_1基因分别重组到能有效表达K_(99)菌毛抗原的pGK_(99)之K_(99)基因(pSK_(219))和pUC_(18)多克隆位点中(pXST系列)。从而成功构建了能表达ST_1-K_(99)两种抗原的工程菌苗候选株pSK_(219)以及能表达ST_1抗原的工程菌株pXST。利用这两种基因重组株的表达产物制备了免疫原。经BALB/c鼠免疫效果研究证实,所构建的pS_(219)菌苗候选株安全无毒,且pSK_(219)中K_(99)基因赋于ST_1基因免疫原性。pSK_(219)免疫接种鼠血清及其初乳均可中和ST_1毒性(1个鼠单位),具有较好的免疫保护作用。pSK_(219)工程菌株作为菌苗候选株,为幼畜大肠杆菌性腹泻多价工程菌苗的研制奠定了基础。

一种包被抗原稳定剂的研制及其特性鉴定

以纯化的狂犬病病毒2μg/mL包被酶标板,将乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖分别以5%(W/V)的终浓度加到1%BSA+4%PEG的PBS中,所制备的溶液作为封闭剂,研究其对于37℃贮存板的稳定性,从中选取最佳的封闭剂组合,并研究其对于乙肝表面抗原、猪瘟病毒E2抗原和猪繁殖与呼吸综合征nsp2基因原核表达产物在包被状态下的稳定性。结果显示,以1%BSA+4%PEG+5%蔗糖的PBS溶液的封闭效果最佳,该封闭剂对于乙肝表面抗原、猪瘟病毒E2抗原和猪繁殖与呼吸综合征nsp2基因原核表达产物也具有良好的稳定性。

牛魏氏梭菌浓缩氢氧化铝灭活苗的制备及其免疫兔的抗体动态变化研究

将牛源魏氏梭菌磐石、双阳、德惠菌株作为生产菌苗株，制备浓缩甲醛氢氧化铝灭活苗，该苗安全性好，免疫后３０天以２个致死量强毒攻击，可获１００％保护，免疫后２００天以同样剂量攻击仍可获９０％保护。经氢氧化铝与蜂胶佐剂对比试验，氢氧化铝佐剂比蜂胶佐剂免疫效果好。抗体动态试验表明，免疫后３０～５０天，菌体抗体和毒素抗体均达最高峰。用兔血清进行中和试验表明，免疫后３０天兔血清能中和８（ＭＬＤ）毒素，小鼠全部存活。

产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌表达产物的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）经动物试验证实没有毒性。从ＩＰＴＧ诱导后的工程菌中提取包涵体，再辅以氢氧化铝胶制成抗原，免疫小鼠３０ｄ后，用产气荚膜梭菌强毒株培养上清及培养菌体攻击，结果免疫鼠能抵抗至少２ＬＤ１００的攻击，证明Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）工程菌株表达产物具有良好的免疫原性。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1/K99/LacZ基因重组的研究

将构建的ｐＢＳＴ２～６工程菌质粒用限制性内切酶ＢａｍＨＩ／ＢｇｌⅡ酶切，经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱，回收１４７ｂｐ的目的ＳＴ１基因。随之将该基因分别重组到能有效表达Ｋ９９菌毛抗原和ＬａｃＺ酶的ｐＧＫ９９之Ｋ９９基因ＢｇｌⅡ位点和ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ位点中。通过ＳＴ１基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及ＤＮＡ序列分析，筛选并鉴定出了理想重组子，从而构建出了能分别表达ＳＴ１融合基因产物的工程菌株ｐＳＫ２１９和ｐＸＳＴ１。

抗ICAM-1单克隆抗体的生物学功能研究

本研究通过体外细胞试验和体内动物试验,对已制备的抗细胞间粘附分子1(ICAM-1)单克隆抗体(MAb)4F1和2C5的生物学活性进行检测。间接免疫荧光试验表明:这两株ICAM-1 MAb可以与人血管内皮细胞ECV304细胞中的ICAM-1结合。以乳酸脱氢酶释放法检测ICAM-1 MAb抑制单核细胞与血管内皮细胞的黏附作用。4F1和2C5 MAb分别可以使细胞黏附降低34.4%和26.9%。二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验和毛细血管通透性试验表明:ICAM-1 MAb能够抑制小鼠耳廓肿胀度,使伊文思蓝渗出量降低。本研究证明所制备的MAb均具有阻断ICAM-1及抑制炎症反应的功能,其中4F1生物学活性高于2C5。

吉林省黄牛“猝死症”病原菌的分离与鉴定

对38头猝死病牛的脏器进行了细菌学检查,魏氏梭菌的分离率为100％,费劳地氏柠檬酸杆菌和绿脓假单胞杆菌的分离率均为59％,变形杆菌的分离率为37％,个别病牛还捡出腐败梭菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌及肺炎双球菌,大多数病牛可检出2种以上菌。几种主要分离菌的致病力试验表明均有较强的致病力,其中以魏氏梭菌的毒力最强。魏氏梭菌经中和试验确定为A型,同时部分病牛的肠毒素检查为阳性,可被A型抗毒素所中和,因此初步证明吉林省黄牛“猝死症”的主要病原是A型魏氏梭菌。为排除健康牛带菌的可能性,对非发病区屠宰的20头健康牛材料做了同样检验,除在1头牛的肝脏检出极少的魏氏梭菌外,其余均未检出任何细菌。

牛“猝死症”特异性治疗试验

近几年来,我国吉林、黑龙江、山东、安徽、海南、贵州、陕西等省饲养的牛出现一种发病急、死亡快、死亡率极高的一种病,暂时统称“猝死症”。患牛一般体温不高,肌肉震颤,心跳疾速,尿频,无食欲,腹胀,卧地不起,突然死亡。病程长者可在发病后1—2小时死亡。根据姚湘燕等的报道,该病是由魏氏梭菌引起,我们从病死牛脏器分离出 A型魏氏梭菌,并用该菌免疫牛,制备了高免牛抗A型魏氏菌血清。在吉林省永吉县河湾子镇畜牧兽医站作了治疗试验,取得了满意的结果。