tRF-013354介导阿霉素诱导的足细胞损伤的机制研究

目的:探究tRNA衍生片段013354(tRF-013354)在阿霉素(ADR)诱导的足细胞损伤中的作用及相关机制。方法:用ADR诱导足细胞损伤模型,tRF-013354 mimic和tRF-013354 NC-mimic分别转染足细胞,Real-time PCR(RT-PCR)验证转染效率,CCK-8检测足细胞存活率,免疫荧光检测足细胞损伤标志物Nephrin、Podocin的定位和表达水平,Western blot检测Nephrin、Podocin和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白非磷酸化β-catenin、Wnt1的蛋白表达水平,RT-PCR检测tRF-013354的表达;用Wnt信号拮抗剂Dickkopf-1(DKK1)阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot检测非磷酸化β-catenin和Nephrin、Podocin的蛋白表达水平,RT-PCR检测tRF-013354的表达。结果:1μg/mL ADR干预足细胞24 h,可成功构建ADR诱导足细胞损伤模型,Wnt/β-catenin信号通路被激活,tRF-013354下调(P<0.05);足细胞过表达tRF-013354可减轻足细胞损伤;DDK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,与ADR组比较,ADR+DKK1组足细胞损伤减轻,tRF-013354表达上调(P<0.05)。结论:tRF-013354可能作为Wnt/β-catenin信号通路的下游效应分子减轻ADR诱导的足细胞损伤。

微小RNA-26a通过抑制铁死亡减少高糖诱导的肾小管上皮细胞细胞外基质合成

目的 探究微小RNA-26a(miR-26a)对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞(RTECs)细胞外基质(ECM)合成的作用及可能机制。方法 通过HG诱导RTECs以构建糖尿病肾病(DKD)模型,在HG诱导的RTECs中过表达miR-26a,使用RT-qPCR和Western blot检测ECM合成及铁死亡相关指标以评估miR-26a对HG诱导的RTECs中ECM合成及铁死亡的作用。使用ferrostatin(Fer-1)抑制DKD模型中铁死亡的发生并进一步评估其对ECM合成的影响。RT-qPCR和Western blot检测铁死亡的相关指标,荧光显微镜观察活性氧(ROS)荧光强度。结果 与Control相比,HG组细胞中miR-26a表达量降低,ECM合成相关指标fibronectin和collagenⅠ表达量升高,过表达miR-26a后,与HG组相比,HG+miR-26a组细胞miR-26a表达量升高,fibronectin和collagenⅠ表达量降低。在铁死亡方面,与Control组相比,HG组SLC7A11和GPX4的蛋白和mRNA表达量降低,TFR-1和ACSL4表达量升高,ROS荧光强度增强。抑制铁死亡后,HG+Fer-1组铁死亡及ECM合成相关指标表达水平较HG组均改变。再次过表达miR-26a后,HG+miR-26a组铁死亡相关指标表达水平较HG组均变化,ROS荧光强度降低。结论 在HG诱导的RTECs中,miR-26a抑制铁死亡的发生进而减少ECM合成。

N-乙酰半胱氨酸对血管紧张素Ⅱ诱导的HK-2细胞炎症相关因子的抑制作用

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所诱导的HK-2细胞炎症相关因子的抑制作用。方法将HK-2细胞分为四组(对照组、AngⅡ组、NAC组、AngⅡ+NAC组),以NAC(5 mmol/L)、AngⅡ(1 mmol)处理细胞,于48 h后收集细胞,PCR法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素6(IL-6) mRNA水平的变化;Western blot法检测TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素1β(IL-1β)蛋白的表达变化;免疫荧光法观察TNF-α的荧光表达分布情况。结果与对照组相比,AngⅡ组HK-2细胞内炎症因子蛋白(TNF-α、MCP-1和IL-1β)、mRNA(TNF-α、IL-6)表达上调,经NAC处理后,AngⅡ+NAC组以上变化均减小,免疫荧光检测也显示相同结果。结论 NAC能抑制AngⅡ诱导的HK-2细胞内炎症相关因子的表达。

tRF-003634对阿霉素肾病小鼠足细胞凋亡的作用和机制研究

目的探究转运RNA衍生片段003634(tRNA-derived fragment 003634,tRF-003634)对阿霉素(adriamycin)肾病小鼠足细胞凋亡的作用及机制。方法①用BALB/c小鼠作为对象来建立阿霉素(10 mg/kg)肾病模型。取20只BALB/c小鼠随机分为:对照组、阿霉素组(ADR组)、ADR+tRF-003634 agomir组、ADR+tRF-003634 NC组(n=5)。检测各组小鼠的血清生化指标水平,H-E染色、PAS染色评估小鼠肾脏病理变化;Real-Time PCR法检测各组肾脏中tRF-003634的表达水平;Western blot法用来检验肾脏组织中caspase3、cleaved caspase3和p53的蛋白表达水平。②体外用阿霉素(1 mg/L)诱导足细胞凋亡。依据不同干预因素将足细胞分为:对照组、ADR组、ADR+tRF-003634 mimics组和ADR+tRF-003634 NC组。Real-Time PCR法测定各组tRF-003634的表达水平;Western blot法用来测定不同组别间足细胞中caspase3、cleaved caspase3和p53的相对表达。③将足细胞分成:对照组、ADR组、ADR+SB203580组和SB203580组。利用Western blot法来检测每组p-p38MAPK和p-Hsp27的蛋白相对表达,Real-time PCR法检测tRF-003634的表达水平。结果①与对照组相比,ADR组的病理变化显著加重,tRF-003634的表达水平下降,cleaved caspase3和p53的表达水平显著上升(P<0.05)。与ADR组相比,ADR+tRF-003634 agomir组小鼠24 h尿蛋白和血清尿素氮水平显著下降(P<0.05),病理改变减轻;tRF-003634表达水平明显上升,cleaved caspase3和p53表达水平显著下降(P<0.05)。②与对照组相比,ADR组足细胞中tRF-003634表达水平显著下降,cleaved caspase3和p53表达水平显著上升(P<0.05)。与ADR组相比,ADR+tRF-003634 mimics组的tRF-003634表达水平显著上升(P<0.05),cleaved caspase3和p53表达水平显著下降(P<0.05)。③与对照组相比,ADR组p-p38MAPK和p-Hsp27表达上调,tRF-003634表达下降(P<0.05);与ADR组相比,ADR+SB203580组p-p38MAPK和p-Hsp2蛋白表达显著下降,tRF-003634表达上升(P<0.05)。结论tRF-003634能够抑制足细胞凋亡,减轻阿霉素诱导的肾脏病理损伤。tRF-003634可能作为MAPK通路的下游效应分子改善足细胞凋亡,为慢性肾脏病的诊治提供新的思路。

RREB1对TGF-β1诱导系膜细胞增殖的影响

目的:探讨ras反应元件结合蛋白1(ras responsive element binding protein 1,RREB1)对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导大鼠系膜细胞增殖的影响。方法:用TGF-β1及RREB1-siRNA转染干预系膜细胞,CCK-8法检测系膜细胞增殖活力,RT-PCR法检测细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)及RREB1 mRNA水平,Western blot法检测PCNA、α-SMA及RREB1蛋白的表达,流式细胞术检测系膜细胞周期。结果:与对照组相比较,TGF-β1干预后CCK-8法检测系膜细胞增殖活力增加(P<0.01),PCNA、α-SMA及RREB1 mRNA和蛋白水平增加(P<0.01),细胞周期检测提示S期细胞百分率增多,G1期细胞百分率减少(P<0.01);与TGF-β1组相比较,RREB1-siRNA转染+TGF-β1干预后的系膜细胞增殖活力下降(P<0.01),PCNA、α-SMA及RREB1 m RNA和蛋白水平下降(P<0.01),细胞周期提示S期细胞百分率降低,G1期细胞百分率升高(P<0.01)。结论:TGF-β1通过上调RREB1的表达诱导系膜细胞增殖。