PCR-DGGE技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradientg elelectrophoresis,DGGE)技术目前已经成为研究微生物物种多样性和动态变化的分子检测工具之一。该技术不依赖于微生物的分离培养,便能快速、准确地获取复杂样品中微生物的菌群组成及其遗传信息,因此被广泛应用于微生物生态学、食品微生物学等领域。但DGGE技术存在一定的局限性,有时会造成分析结果的偏差。本文简单概述了DGGE技术的基本原理及其在微生物群落分析中的应用,重点对造成DGGE结果偏差的因素,如DNA提取、PCR扩增、DGGE条件以及DGGE图谱分析等进行讨论,并提出相应的解决措施,旨在对DGGE检测结果的分析提供参考。

利用PCR-DGGE技术分析乳制品中的乳酸菌(英文)

在食品发酵行业,需要一种简捷有效的方法检测发酵产品中的有益微生物.聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(Ploymerase chain reaction and denaturing gredient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术广泛应用于微生物生态学的研究.采用PCR-DGGE对5种含有乳酸菌的乳制品进行了菌群组成分析,并通过传统培养方法和核酸序列分析进行了验证.结果表明,所有测试样品中的活菌数量都在106～109 cfu/mL之间,通过平板培养法分离出了形态明显的杆状菌和链球状菌,对其进行16S rDNA核酸序列测定及同源性分析,将其鉴定为德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus).建立了由已知乳酸菌组成的DGGE参考阶梯(Reference ladder),可用其对相应菌株进行DGGE鉴定.用两对不同引物进行PCR-DGGE分析,除样品1外,试样中均检测到德氏乳杆菌和嗜热链球菌.对DGGE参考阶梯未能直接鉴定的样品1的电泳条带进行回收、序列分析,分别鉴定为卷曲乳杆菌(L.crispatus)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus).同时发现,引物R518-F357对嗜热链球菌模板的识别效率高于引物Lac1GC-HDA2.以上结果表明,RCR-DGGE技术可以对样品中的乳酸菌进行快速的分析和鉴定.

发酵乳杆菌β-半乳糖苷酶转糖基活性研究

从传统发酵乳制品中筛选到1株转糖基活性较高的乳杆菌，经16SrDNA菌种鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum，EU621851）K4。以乳糖为底物，研究β-半乳糖苷酶粗酶液在不同pH、乳糖浓度、反应温度和时间的转糖基活性。结果表明在pH5．5、乳糖20％、温度50℃条件下反应48h，转糖基活性最高，能生成多种低聚半乳糖。研究发现在低乳糖含量（5％）和pH5～7范围内都具有明显的转糖基活性。用牛奶为原料进行转糖基能力测定，结果该酶既能降低牛乳中的乳糖含量，又能生成低聚半乳糖。因此，菌株Lb．fermentum K4在乳制品发酵中具有潜在的应用价值。

产广谱细菌素乳酸菌的筛选

利用牛津杯双层平板法从70株乳酸菌中筛选得到2株具有较高抑菌活性的乳酸菌LAB30、LAB211。研究这2株乳酸菌的抑菌物质发现:排除酸性产物乳酸、乙酸以及过氧化氢的干扰,LAB211和LAB30仍具有较高的抑菌活性;对其发酵液进行蛋白酶处理,LAB30的发酵液经胰蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌活性均有降低;而LAB211的发酵液经蛋白酶K处理后有所降低,胰蛋白酶处理没有变化,因此可以判定这两株乳酸菌产生的抑菌物质为细菌素。利用特异性引物PCR分析可知,LAB211和LAB30产生的细菌素并非nisin。抑菌谱实验表明,LAB30和LAB211的发酵液不仅抑制革兰氏阳性菌,而且对部分革兰氏阴性菌也有抑制作用。因此LAB211和LAB30产生的是一类广谱细菌素。

棘孢曲霉SM-L22β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分.通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5.该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定.Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用.底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖.作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 ( 10-3 mol/L 和11.93 ( 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 ( 10-4 mol/L/min和7.139 ( 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1.

黑色葡萄状穗霉S607耐碱性纤维素酶发酵条件的研究

研究了耐碱性纤维素酶生产菌株黑色葡萄状穗霉S6 0 7(StachybotrysatraS6 0 7)的产酶条件。结果表明 ,S6 0 7的最适生长和产酶 pH为 7.0 ,最适产酶温度为 2 8℃ ,摇床最适转速为 180r/min。在以 2 .0 %纤维素粉和 2 .5 %的麸皮作为碳源时产酶最高 ,添加含 (NH4 ) 2 SO4 、尿素和蛋白胨的复合氮源对生长和产酶有明显的促进作用。在最适培养条件下 ,发酵周期为 4～ 5d ,发酵液中CMC酶活为 2 .12IU /mL ,FP酶活为 1.0 3IU /mL ,β 葡萄糖苷酶活为 0 .86IU /mL。

Paenibacillus sp.K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产-βgalactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillussp.K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18(lac-)为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2 028 bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21(DE3)中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06 U/mL,高于原始菌株的4.55 U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。

利用PCR-DGGE技术分析微生态制剂在传代过程中的菌群变化

利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术,结合传统平板培养法对实验室研制的1种由乳酸菌和芽孢杆菌组成的微生态菌剂WS-401及其在连续转接培养过程中细菌种群组成的动态变化进行分析。WS-401原液的活菌数为2×107cfu/mL,且细胞个体形态多样。将分离自原液的3株细菌进行DGGE分析,出现2种指纹谱带,对照标准的DGGE指纹图谱库和序列分析,分别被鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。将该菌剂分别在LB和MRS两种培养基中30℃或37℃连续转接5次,DGGE分析每次转接后培养物的菌群组成,结果发现,随着转接次数的增加,微生物菌群的种类减少,在LB培养基中转接5次后优势菌群只有蜡状芽胞杆菌,而在MRS培养基中转接后优势菌群为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。由此说明,微生物的营养基质和培养条件对微生态制剂在传代过程中的菌群组成和动态变化有重要影响。

一种适于微生物多样性分析的青贮饲料总DNA的提取方法

目的:提出一种适于微生物多样性分析的青贮饲料中微生物总DNA的提取方法,并评价其效果。方法:间接法抽提样本的总DNA,通过琼脂糖电泳、紫外吸收及PCR分析DNA质量,DGGE评价提取效果,用PCR扩增目的菌株的特定片段来检测提取方法的灵敏度。结果:两个样本DNA的A260/A280值分别为1.99和1.93,A260/A230值分别为2.19和1.90,提取的DNA不需纯化便可直接用于16S rRNA基因的扩增,提取方法灵敏度为3cfu/g,DGGE结果表明提取方法可以涵盖样品中的所有微生物。结论:提取的DNA纯度较高,可直接用于下游分子操作,提取方法灵敏度较高,能全面反映样品中的微生物原貌,可用于免培养法研究青贮饲料中的微生物菌群组成。

乳酸乳球菌nisin抗性基因的克隆及作为筛选标记的研究

在添加500 U/mL nisin和溴甲酚紫的GM17选择性培养基上,分离到5株nisin抗性菌株。根据形态观察,生理生化特性和16S rDNA基因序列比对被鉴定为乳酸乳球菌。根据已报道nisin抗性基因设计引物,分别以这5株菌的染色体和质粒DNA为模板进行PCR扩增,结果从1株抗性菌株的染色体上得到目的基因产物。通过序列测定和同源性比对,证明为nisin抗性基因(nsr)。将nsr基因克隆到乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pTRKH2上,重组质粒命名为pT-nsr。pT-nsr电转化乳酸乳球菌MG1614,获得的重组菌MG1614/pT-nsr在含有500 U/mL nisin的培养基中生长情况良好。这表明nsr基因赋予宿主菌抗nisin特性,并且与红霉素抗性功能相同,因此nsr基因可以作为筛选标记用于食品级载体的构建。

基于CiteSpace软件的地理区域认知核心素养可视化研究分析

基于地理区域认知核心素养的研究现状,搜集国内学者近7年的区域认知研究热门领域。为保证研究结果的可靠性,运用信息可视化软件CiteSpace,涉及798篇地理区域认知核心素养相关研究文献的发文量、作者、机构和关键词。结论表明:研究的热门领域偏向于核心素养、高中地理、培养策略、地理教学、初中地理、教学设计、综合思维、教学策略等,地理区域认知核心素养结合教学模式划分得更加具体化和多元化。

浅析一种基于SIP协议的楼宇对讲系统设计

随着楼宇对讲产品进入互联网时代,楼宇对讲产品在老旧小区智能化改造中形成了新的场景和用户需求。本文以实际项目中设计并大规模应用的一个基于SIP协议的楼宇对讲系统为例,从智能化和物联网技术角度对楼宇对讲系统的设计进行说明,并对存在问题和发展方向进行分析。本文中的SIP楼宇对讲设计案例,具有实用参考价值,可供相似项目借鉴。

食源性乳酸菌抗药性分析

抗生素的不合理使用导致病原菌耐药性已成为威胁人类健康的公共问题。乳酸菌在食品发酵、饲料青贮等领域具有悠久的应用历史,是公认的安全性菌株。但是研究发现,有些乳酸菌具有抗药性,根据抗药因子的可转移性,乳酸菌的抗药性可分为固有抗药性和外获抗药性。外获抗药性多由接合质粒或转座因子编码,这些抗药基因随发酵食品或益生菌剂进入肠道,是否与肠道共生菌或病原菌进行传递进而对机体带来危害引起了人们的关注。本文就食源性乳酸菌抗药性产生的分子机制、检测方法以及可能的抗药基因水平转移方式进行综述,以便对食源性乳酸菌的抗药性有一个全面认识。

核苷酸补救途径在肌苷代谢中应用的研究

运用核苷酸补救途径理论 ,采用枯草杆菌肌苷产生菌 ,在培养过程中添加次黄嘌呤 ,作为从头合成途径 (denovo)的补充 .此方法应用于工业化生产 ,肌苷产率大幅提高 .

猪札幌病毒病的发病机制、流行病学和诊断

目前,已分别从家猪和野猪身上检测到猪札幌病毒的8个基因型(GIII、V-IX)和3个基因型(GIII、GV、GVI)。GIII型Cowden毒株在绒毛上皮细胞中复制,并在近端小肠(主要在十二指肠,较少在空肠)引起肠道损伤,导致轻度至重度腹泻,但猪札幌病毒在不同年龄的腹泻猪中的作用仍不明确。基于此,本文对猪札幌病毒病的发病机制、流行病学和诊断进行探讨,为该病的防控提供参考意见。

地理学科核心素养导向下的SCD智慧教学模式研究

在智慧教学平台技术支持下,以自主学习、合作学习、深度学习理论为依据,构建SCD智慧教学模式,培养学生地理高阶思维,提升学生信息技术运用能力,促进学生个性化、全面化发展,落实地理学科核心素养培养。