分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株的建立及其特性的研究

通过大鼠、小鼠对AFM1-BSA抗体应答的比较,选用应答强的大鼠脾细胞作为亲本细胞,与小鼠骨髓瘤P3X63-Ag8.653系细胞融合制作杂交瘤。经HAT培液选择和RIA的筛选,克隆化,最终获得生长良好、稳定分泌抗AFM1抗体的5株大鼠-小鼠淋巴细胞杂交瘤细胞株。以ELISA,竞争结合的RIA进一步证明获得的5个单抗是针对AFM1,并与其衍生物AFB1有明显的交叉反应。5个单抗亲和力的平衡常数K为10^+—10^(11) l/M,这表明这些单抗具有组建检测AF试剂盒的潜在实用价值。

单克隆抗体组建黄曲霉毒素酶免疫检测试剂盒的研究

单克隆抗体组建黄曲霉毒素酶免疫检测试剂盒的研究季永镛，林国妹，叶敏（中国科学院上海细胞生物学研究所，上海２０００３１）陆建华，李文广（江苏启东肝癌防治研究所，江苏启东２２６２００）本文报告以高亲和力抗黄曲霉毒素（ＡＦ）单克隆抗体为基础组建的ＡＦＮ免疫...

一种适用于筛选半抗原单克隆抗体的放射免疫方法

设计了一种简便的检测抗半抗原抗体的放射免疫方法(RIA)。它的特点是:可以用免疫原(半抗原—载体)标记^(125)I作抗原,通过载体的竞争结合,能特异地检测以半抗原—载体免疫的抗血清中的抗半抗原抗体。这样免避了检测抗半抗原抗体的一般方法所要求的必须有两种不同载体的半抗原—载体复合物,分别用于动物的免疫和抗半抗原抗体的检测。因此,本设计省略了一种半抗原—载体的制备,对偶联方法繁复的半抗原、载体来说尤有意义。本检测方法也具有RIA的一般特点,即对标记的半抗原—载体的需求量远比ELISA所需求的量少,这对来源稀少,价格昂贵的半抗原来说,尤其对样品数大的筛选杂交瘤中的应用来说是十分重要的。实验还表明本检测方法可以特异地检测杂交瘤培养物上清液中的抗半抗原抗体,方法的灵敏度甚高。

应用流式细胞仪定量评估人—鼠杂交瘤株细胞抗体生成功能稳定性的研究

用FACS分析和Luria-Delbrǔck方程计算淋巴细胞杂交瘤株细胞丧失抗体生成功能的突变机率(μ),以评估杂交瘤的稳定性。结果表明μ值大,则杂交瘤不稳定,易丧失抗体生成功能,反之则杂交瘤比较稳定。实验证明所建立的方法能反映杂交瘤稳定性的程度,具有实验少人为主观因素干扰,统计意义强,适用范围广等优点。

体外诱发抗体生成过程中淋巴细胞的变化

为了了解体外抗体应答中T、B淋巴细胞的变化,以进一步阐明体外抗体应答的细胞学过程,并为完善体外免疫实验系统提供方向和依据,利用荧光激活细胞分选仪(FACS),在本实验室建立的人淋巴细胞体外免疫实验系统的基础上,对体外诱发抗体应答中淋巴细胞的变化进行了分析和研究,得到以下初步结果。一、T细胞所占比例的变化与设置培养物时细胞浓度相关,如果T细胞一开始占比例较大时,其变化为下降,否则其变化为上升。但最终都维持在30%上下。二、CD4^+(T辅助)细胞和CD8^+(T抑制)细胞的变化在扁桃体细胞和脾细胞中有所不同。在两周的培养过程中,前者无论加或不加C.M.(T细胞条件培液)或MTG(混合丝裂原),CD4^+细胞的比例均高于CD8^+细胞;而后者在加了C.M.或MTG后,CD8^+细胞的比例明显上升,但CD4^+细胞却有下降趋势。论文讨论了上述变化与免疫应答强度的可能关系。此外,亮氨酸甲酯(Leu-O-Me)的加入对CD8^+细胞没有影响。三、B淋巴细胞的变化,在培养两周过程中,无论扁桃体还是脾脏来源的细胞,B细胞富集的程度没有发生明显的变化,直至培养结束时,B细胞的比例仍维持在60%左右。T、B细胞间的比例也无明显变化,这表明所建立的体外免疫实验系统对B细胞的存活及其应答的诱发是适宜的。CD19^+B细胞的变化较为明显,其意义目前尚难推测。此外,一般认为CD5^+B细胞是一类分泌自身抗体的细胞,在培养过程中一直处于少数,未见增多。四、对于本实验中设置“框界”(“gating”)的合理性进行了讨论。

应用流式细胞仪研究抗IL-8单抗对IL-8激活人颗粒细胞活力的中和作用(英文)

以IL-8免疫的BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0或653小鼠骨髓瘤细胞融合构建了淋巴细胞杂交瘤克隆I8-S2和I8-63。ELISA叠加试验(ELISA Additivity Test)表明这两杂交瘤克隆分泌的单抗分别识别IL-8分子的不同表位。IL-8能激活人颗粒细胞,引起细胞内Ca^(2+)浓度([Ca^(2+)]_i)上升。通过流式细胞仪分析[Ca^(2+)]_i的变化,发现两个克隆单抗对IL8激活细胞的活力具有不同的中和作用。克隆I8-S2具有很强的中和作用,而克隆18-63则不然。上述结果提示IL-8的激活细胞活力局限于该分子的某表位。

用荧光激活细胞分选仪检测细胞存活的两种不同染色方法的比较

本文比较了用PI和FDA两种不同染料, 通过FACS来检测细胞的存活,表明两种不同染料所得结果均能正确反映细胞存活的情况,而且两者的结果是一致和稳定的。并讨论了这两种方法应用于FACS检测中的优点。

抗体酶催化Oxy-Cope重排反应的研究

经七步反应合成了Oxy-Cope重排反应的过渡态类似物-2-对羧丙氧基苯基环已醇(3),并以此为半抗原联接载体蛋白BSA制成抗原后免疫动物,从动物血清中分离纯化得到多克隆抗体。在200mmol/L的MES(4-吗啉乙磺酸)和200mmol/L的NaCl缓冲液中(pH=6.0),底物和抗体的摩尔比为100:1及37℃条件下,该抗体能催化3-对甲氧苯基-4-羟基-1,5-已二烯(1)重排生成6-对甲氧苯基-5-烯-已醛(2),v_(max)=15μmol/L·min,K_M=1025μmol/L,K_(cat.)=10min^(-1)。

人淋巴细胞的体外抗体诱发及其在杂交瘤中的应用

本文应用手术切除的人扁桃体或外伤脾为材料,在体外诱发了针对不同类型抗原的抗体应答,其中包括羊红细胞、卵白蛋白、破伤风类毒素和乙肝病毒表面抗原的抗体应答,并应用破伤风类毒素体外激活的人B淋巴细胞制作杂交瘤。根据多次融合的结果表明其融合率平均为52.1%,抗体阳性率为15.6%,分泌IgM和IgG抗体的阳性集落孔的比例接近1∶1。我们还研究了体外诱发人淋巴细胞产生抗体的条件,发现细胞类群(在本研究中是采用不同的细胞分离方法)是主要的影响因素,值得进一步研究。目前所建立的体外免疫实验系统,主要是应用尼龙毛柱法富集B细胞,在96孔培养板上加上一定剂量范围的抗原刺激。为了协助淋巴细胞反应,可再加10%的T细胞条件培液或少量丝裂原混合物(LPS0.1μg/ml+PWM1μg/ml)。

人源CDC50基因的分子克隆及在E.coli中的表达

糖皮质激素受体 (GR)为一种特异性配体诱导的转录因子在机体发育、生理及行为等过程中发挥重要作用 .这一过程往往受到转录协同调节因子的控制 ,包括协同抑制因子或协同激活因子的作用 .克隆了人源双跨膜受体分子 ,并命名为hCDC5 0 .该分子编码区有 10 5 6bp ,与鼠源基因mCDC5 0在核苷酸水平有 90 %一致性 .将hCDC5 0蛋白的 16 4～ 317编码序列与GST融合构建原核表达质粒进行重组蛋白的表达与纯化并制备多抗 .用二维双向扩散检测抗体为阳性 ,抗原的滴度为12 5 μg/ml.体外翻译研究显示该基因编码蛋白约为 4 0kD ,与Western检测在动物细胞中的表达一致 .用hCDC5 0真核表达质粒与GR萤光报告系统共转染COS 7细胞显示 ,hCDC5 0对GR信号转导有明显的抑制作用 ,其对GR信号通路的抑制作用达 3～ 4倍以上 .hCDC5 0可能为一个新的协同抑制因子 。

催化2-(对甲氧苯氧基)-四氢吡喃缩醛键水解的抗体研究

以2-[对-(3-羧基)-丙基氧苯]-亚氨基哌啶(2)为半抗原,联接载体蛋白后免疫动物,并经杂交瘤技术获得十株单克隆抗体,其中一株单抗1D_1在pH=5.6,37℃条件下能催化2-(对-甲氧苯氧基)-四氢吡喃(1)缩醛键水解。

同种异体小鼠淋巴细胞杂交瘤腹水的诱生

本文研究了分泌抗天花粉蛋白ＩｇＥ抗体的同种异体小鼠杂交瘤株（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）ＴＥ１的腹水的诱生，最佳诱生腹水的宿主是遗传背景相容的Ｆ１（Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）小鼠，其次是与杂交瘤亲本骨髓瘤细胞ＮＳ－１遗传背景一致的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，同时比较了各种免疫抑制处理宿主的腹水诱生率，其中以照光处理最佳，此外对杂交瘤株进行“驯化”，得到了易于诱生腹水并且抗体效价高的杂交瘤细胞。

小鼠抗天花粉蛋白IgE型单抗的酶解及其Fab的制备

研究了Ｐａｐａｉｎ及Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解小鼠抗天花粉蛋白ＩｇＥ单抗的条件及Ｆａｂ的制备。Ｐａｐａｉｎ和Ｔｒｙｐｓｉｎ两者都可产生Ｆ（ａｂ′）_２，分子量在１５０～１６０ｋＤ左右；经Ｐａｐａｉｎ裂解的主要产物中还有Ｆａｂ，分子量７２ｋＤ，可通过凝胶过滤获得纯的Ｆａｂ。而Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解物经ＤＴＴ还原、碘乙酰胺烷化虽然也可得到Ｆａｂ′（ｔ），但不易纯化；可见，要制备Ｆａｂ以采用Ｐａｐａｉｎ裂解为好，而制备Ｆ（ａｂ′）_２则可采用Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解。这二个酶的裂解速度是Ｔｒｙｐｓｉｎ大于Ｐａｐａｉｎ。

用体外免疫的人淋巴细胞建立抗破伤风类毒素的杂交瘤克隆

我们应用破伤风类毒素体外免疫的人扁桃体细胞和人-鼠异源骨髓瘤RF 系细胞进行融合,从中筛选到一株杂交瘤细胞89112—50,并通过克隆化筛选获得了两个亚克隆,其分泌的抗体是抗原特异的,和三种抗原(OVA、TC-S、FYG)都不交叉,分泌抗体的功能也比较稳定,在培养瓶内连续扩增传代13次后,仍维持相当高的抗体分泌能力,在常规传代培养过程中所收集的培养物上清液中抗体的含量平均为69.6μg/ml。

应用FACS测定细胞激活时胞内钙离子浓度的变化

细胞内钙离子浓度([Ca^(++)]i)的升高,是淋巴细胞激活和增殖过程中早期呈现的一个重要现象。本文报告应用流式细胞仪(FACS)测定[Ca^(++)]i变化的一种方法。Fluo-3是一种荧光活性物质。它在细胞内与游离Ca^(++)结合后,其荧光强度能增高达40倍。因而,可通过FACS分析细胞的荧光强度,来测定[Ca^(++)]i的变化。然后,通过统计[Ca^(++)]i升高的相对细胞数,了解细胞的激活状况。实验摸索了Fluo-3染色的适宜条件。ConA刺激下,Fluo-3染色淋巴细胞呈现典型的[Ca^(++)]i升高的应答。同时应用罗达明标记的抗Thy1单抗区别T细胞和非T细胞及在ConA刺激下[Ca^(++)]i变化的差异。

一种改良的半定量RT PCR方法

选用细胞因子ＩＬ４ 为靶基因， 以β肌动蛋白（βａｃｔｉｎ） 基因作为内参照， 将两者在同一ＰＣＲ体系中扩增， 分析ＰＣＲ扩增的动力学， 内参照βａｃｔｉｎ 的引物于ＰＣＲ扩增中的滞后加入， 弥补了ＩＬ４ 与ＲＴＰＣＲ模板量的差异， 使二者的扩增同时处于指数扩增期， 其扩增产物均可在溴乙锭染色的聚丙烯酰胺胶上检测出， 从而可求出ＩＬ４ 的ｃＤＮＡ 拷贝数占βａｃｔｉｎ拷贝数的百分比。重复实验的ＣＶ 值在１０％ 以内， 表明此半定量ＲＴＰＣＲ 方法的可靠性。

对映选择性催化萘普生乙酯水解的多克隆抗体

根据酶的活性中心能专一性地结合反应的过渡态,降低反应的活化能从而催化反应进行的原理,模拟反应的过渡态,设计并合成一有机分子(其空间结构和电荷分布方面都与反应的过渡态相类似)作为半抗原联接载体蛋白后免疫动物,经细胞杂交技术,成功地获得具有催化功能的抗体。这种把抗体的极其多样性和酶的巨大的催化能力等特性结合在一起的催化抗体,为传统的化学和免疫学研究开辟了一个崭新的方向。自报道第一例能催化酯水解的抗体以来,催化抗体己显示能催化多种反应,包括了酶催化的所有反应类型,如水解反应、基团转移反应、异构化反应、裂解反应、氧化-还原反应以及一些双分子反应等。因此,设计具有特异性的催化抗体,在化学、生物学、医学等领域无疑将显示巨大的应用潜力。

小鼠IL-12受体β2胞内区蛋白表达及多抗制备

从ConA刺激的小鼠脾细胞中抽提总RNA,用RT-PCR的方法克隆出小鼠IL-12R β2亚基胞内区基因。再将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化宿主菌BL-21(DE3),用IPTC诱导宿主菌表达蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,蛋白主要存在于包涵体中。利用割胶回收的方法纯化目的蛋白,免疫兔子制备多抗。经ELISA检测,证明免疫后兔血清中有高滴度的针对IL-12Rβ2亚基胞内区的抗体。

具有催化萘普生乙酯水解能力的多克隆抗体

80年代化学和免疫学领域中的一项重大发现——催化抗体(抗体酶),把抗体的极其多样性与酶的巨大催化能力等特性结合在一起,为传统的化学和免疫学研究开辟了一个崭新的方向.利用经过特殊设计并合成的有机分子作为半抗原,联接载体蛋白后免疫动物并经细胞杂交技术,从筛选和分离的单克隆抗体中,成功地获得具有催化功能的抗体.至今已有50多个反应能用催化抗体来催化,对某些反应(如Diels-Alder反应),自然界不存在能催化它们的酶,也能用抗体来催化进行.因此,设计具有特异性的催化抗体,在化学、生物学、医学等领域无疑将显示巨大的应用潜力.茶普生(1)是一种非常重要的非甾体消炎镇痛药,其S构型的药效为R构型的38倍,研究用抗体催化水解萘普生乙酯(2)来拆分获得S构型的萘普生,具有重要的理论意义和潜在的应用价值.本文简要报道具有催化萘普生乙酯水解能力的多克隆抗体的研究.