基于多模态影像学的轻度创伤性脑损伤脑功能评估的研究进展

轻度创伤性脑损伤(mild traumatic brain injury,mTBI)具有病理生理复杂、早期诊断难、伴有不同程度脑功能障碍等特点,需早期干预才能有效恢复如注意力不集中、记忆力减退等脑功能障碍。上述功能障碍与大脑默认网络、海马、基底节等脑区功能异常密切关联,而影像学可以准确量化评估这些脑功能区的改变。高场强磁共振成像技术的出现,使得影像学成为mTBI临床早期诊断与临床治疗评估的关键技术。基于mTBI动物模型及临床患者,本文从磁共振成像中反映工作记忆的动脉自旋回波、反映认知缺陷的弥散张量成像、反映淋巴转运异常的超高场强磁共振增强成像以及反映颅脑冲击伤损伤程度的正电子发射计算机断层扫描术与脑电图等方面作一综述,旨在为mTBI军事医学研究提供参考。

利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6

目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pISQ,转化E.coliTop10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达。结果获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/E.coli Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带。结论大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础。

新月柄杆菌RsaA分泌系统用于大肠杆菌胞外递送重组蛋白的初步研究

目的:构建基于新月柄杆菌RsaA外运机制的以大肠杆菌为宿主的原核胞外分泌表达载体系统。方法:利用分子克隆手段,按RsaA分泌系统操纵子组织方式,将RsaA系统外运功能基因配合以异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告分子、大肠杆菌M15为宿主菌,诱导表达后通过Western Blotting检测培养上清中GFP的表达。结果:获得了与设计完全一致的pQABPS载体,利用该载体系统,在培养上清中报告分子GFP的表达明显增加,且是通过特异的RsaA外运机制被分泌至胞外的,而非渗漏表达或简单的信号肽引导。结论:在大肠杆菌中重现了RsaA分泌系统的外运功能,为该系统在基因工程领域的应用研究打下了良好基础。

腺苷及其受体在颅脑创伤及慢性认知损害中的作用及临床应用前景

在现代社会，交通事故、坠落、运动意外等引起的创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）和战争、恐怖袭击中爆炸导致的颅脑冲击伤（bTBI）都具有发生率高和死残率高的特点，即使患者表面康复，往往还会遗留慢性神经行为损伤，不仅影响患者工作、生活质量，也给家庭和社会带来沉重负担。

基因工程重组蛋白胞外分泌Ⅰ型系统的研究进展

在基因工程领域,重组蛋白表达后定位于胞内或周质间隙,影响了其表达水平与可溶性,进而影响活性,降低了利用效率。分泌表达至胞外培养基则能较好地解决这一难题。利用细菌天然分泌系统作为重组蛋白胞外递送工具已日益成为生物工程及相关领域的常用策略,其中Ⅰ型分泌系统是研究最多、最具应用前景的。本文简要综述典型的大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌系统以及更具优势的新月柄杆菌SLP(RsaA)分泌系统的生化特性、遗传特征及移植利用等方面的研究进展。

基于新月柄杆菌RsaA外运机制的EspA及EspA-IL-24融合蛋白胞外分泌表达研究

目的:实现大肠杆菌分泌蛋白(Esp)A及EspA与白细胞介素(IL)-24融合蛋白的胞外分泌表达,进一步验证基于新月柄杆菌RsaA外运机制的原核胞外分泌表达载体系统的有效性和通用性,并改造优化该系统。方法:利用分子克隆手段,按RsaA分泌系统操纵子组织方式,将获得的RsaA系统元件编码序列和异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒,构建新的胞外分泌表达质粒pQABP2S;以大肠杆菌为宿主菌诱导表达EspA及EspA-IL-24融合蛋白,并通过Westernblot检测目标蛋白在培养上清中的表达。结果:获得了新的胞外分泌表达载体pQABP2S;与对照相比,该载体宿主系统培养上清中目标蛋白EspA及EspA-IL-24的表达量明显增加。结论:在大肠杆菌中通过RsaA分泌系统可实现分子大小不同的EspA及EspA-IL-24融合蛋白的特异性分泌表达,进一步证实该分泌表达策略的有效性和通用性;调整调控序列以优化分泌系统的尝试,为此类基因工程技术平台的开发提供了借鉴。

原核融合表达载体的设计、构建及应用

目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白。分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性。结果构建的表达载体pEspA可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白获得高效表达。先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合表达及纯化又提供了一种可供选择的工具。

Smad3基因siRNA对TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖的影响

目的构建大鼠Smad3基因特异性siRNA沉默质粒,并探讨其在TGF-β1双向调节成纤维细胞增殖中的作用。方法构建大鼠Smad3基因沉默质粒,荧光纤维镜观察转染效率,定量PCR、免疫组化法检测Smad3基因和蛋白的变化,BrdU ELISA法和EMSA法分别检测转染siRNA及联合大小剂量TGF-β1刺激后细胞增殖和Smad3结合活性变化。结果沉默质粒转染效率为41.2%,瞬时转染后具有促增殖作用且与转染剂量成正比,并使其mRNA表达下调50%、蛋白表达明显降低,还可降低大小剂量TGF-β1双向调节细胞增殖和Smad3结合活性的变化程度。结论pSUPERSmad3沉默质粒构建成功,TGF-β1可通过调节Smad3来达到双向调节成纤维细胞增殖作用。

显微切割联合全自动Western blot在小鼠大脑标记神经元微量蛋白定量中的应用

目的构建及评价收集特定部位的标记神经元,对这类神经元的微量蛋白水平采用定量的方法,并将此方法初步应用于小鼠颅脑创伤后海马亚区神经元中。方法硫堇染色未固定处理的冰冻切片脑组织神经元,激光显微切割收集海马CA1区和DG区神经元,全自动毛细管Western blot检测收集细胞的磷酸化蛋白激酶A(p-PKA)蛋白水平。结果全自动毛细管Western blot对低浓度蛋白的检测下限低于传统Western blot 1个数量级,其线性相关系数为98. 85%,日内和日间精密度分别为2. 50%和4. 09%。本方法应用于颅脑创伤小鼠脑组织,发现伤后1 d海马DG区神经元p-PKA显著增高(P <0. 01),CA1区无变化。结论本方法基于激光显微切割和全自动毛细管Western blot,能够实现精确收集指定神经元并准确定量微量蛋白,成功应用于目标神经元蛋白定量,具有在细胞类型众多且混杂分布的组织中进行细胞和分子水平研究的应用前景。

ROCK1在地塞米松抑制中性粒细胞释放和单核细胞黏附中的作用

目的探讨ROCK1在地塞米松(dexamethasone,Dex)抑制中性粒细胞释放和单核细胞黏附中的作用。方法检测地塞米松和法舒地尔(Fasudil,Fas)抑制佛波脂(PMA)诱导的中性粒细胞释放超氧化物阴离子(O2-)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)以及U937单核细胞黏附的程度,并检测ROCK1和RhoA的表达和活性改变。此外观察糖皮质激素受体拮抗剂——米非司酮(mifepristone,M)和蛋白质合成抑制剂——放线菌酮(cycloheximide,C)对地塞米松这些作用的影响。实验分组:对照组、PMA组、PMA+Dex组、PMA+Dex+M组、PMA+Dex+C组和PMA+Fas组。结果地塞米松可以显著抑制中性粒细胞释放O2-和MPO[(1.25±0.10)vs(1.95±0.10);(1.07±0.06)vs(1.75±0.08),P<0.05],而法舒地尔对其无明显抑制作用(P>0.05)。地塞米松和法舒地尔均可抑制U937细胞黏附[(0.09±0.01)vs(0.08±0.01)vs(0.28±0.06),P<0.05]。米非司酮和放线菌酮并不能影响地塞米松的这些作用(P>0.05)。结论地塞米松以非ROCK1依赖方式抑制中性粒细胞释放;以ROCK1依赖方式通过非基因组效应抑制U937单核细胞的黏附。

脑损伤后脑脊液腺苷浓度测定方法的建立

目的建立人脑脊液中腺苷(adenosine,AD)浓度的检测方法。方法收集脑损伤后病人脑脊液,采用ODS反相C18柱检测,以50mmol/L磷酸二氢钠∶甲醇(80∶20)为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为254nm。结果该方法在检测0.78～15mg/L腺苷浓度有着良好的线性关系(R2=0.9981),保留时间为4.9min,平均加样回收率为(98.59±0.65)%,日内相对标准偏差小于2.46%,日间相对标准偏差小于3.56%。脑损伤病人脑脊液腺苷含量高于正常腺苷范围。结论本方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便等优点,可用于脑脊液中腺苷浓度的测定。

8种氟喹诺酮类药物的体外敏感性

目的 比较大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌对 8种氟喹诺酮类药物的体外抗菌活性。方法 按 NCCL S推荐的标准纸片扩散法 (K- B法 )对 6 9株大肠埃希菌、84株铜绿假单胞菌和 82株金黄色葡萄球菌进行 8种三代氟喹诺酮药物的体外敏感性实验。结果 对于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 ,环丙沙星的体外抗菌活性最强 ;对于金黄色葡萄球菌 ,虽环丙沙星的敏感率低于氧氟沙星、左氧氟沙星及司帕沙星等 ,但并未提示差异有显著性 (P >0 .0 5 )。结论 8种帕喹诺酮类药物显示明显的交叉耐药性 ,环丙沙星的体外敏感性结果对于临床应用三代氟喹诺酮类药物具有一定的指导意义。

腺苷A_(2A)受体在中枢神经系统损伤中的相关研究进展

中枢神经系统损伤以其高发生率和高死残率,已经成为紧迫的世界性公众健康问题,但目前还缺乏公认安全有效的疗法。腺苷A_(2A)受体(A_(2A)R)作为神经精神活动及中枢神经系统损伤的重要调控因子,引起了普遍的关注。目前,研究发现在中枢神经系统损伤中,激活A_(2A)R有加重神经损伤与神经保护的复杂作用。本文即对A_(2A)R在中枢神经损伤中的作用与机制进行探讨。

美军轻度颅脑战创伤诊治进展及启示

在近年的阿富汗和伊拉克战争中,创伤性脑损伤已成为"现代战争的特征性损伤",其中大部分为轻度伤,因发病隐匿、误诊漏诊而造成美军战后出现大量神经精神后遗症患者,给个人、家庭和社会带来深远的影响。该文综述了美军对创伤性脑损伤研究和防治的投入情况及战场中轻度创伤性脑损伤诊断、处理和治疗的进展,并提出了对我军的启示。

原发性颅脑冲击伤致伤机制及病理学特点

在近年的阿富汗战争和伊拉克战争以及恐怖袭击中，由于各种爆炸性武器尤其简易爆炸装置（improvisedexplosivedevices，IEDs）的大量使用，冲击伤成为最主要的伤类。由于个人防护装备（主要是保护躯干）的更新和发展，冲击伤最敏感的靶器官如肺、肠等的损伤及其所致死亡大大减少，但颅脑冲击伤（blast—inducedtraumaticbraininjury，bTBI）却凸显出来，并被定义为“现代战争特征性创伤”。

以Rho／ROCK为靶点治疗创伤性脊髓损伤的研究进展

创伤性脊髓损伤指机械外力作用而非肿瘤、结核、发育等因素造成的脊髓损害，包括原发性和继发性损伤，前者由机械力直接导致，不可逆转；而后者是由原发损伤造成的炎症、水肿、兴奋性毒性、氧化应激等系列级联反应，是决定损伤程度和预后的关键，且可以预防和逆转。目前，脊髓损伤治疗药物主要是针对各类继发性损伤，在这些药物中，针对小G蛋白Rho及其激酶ROCK的药物显示出良好的临床应用前景。笔者拟综述Rho／ROCK信号通路在创伤性脊髓损伤中的作用机制及以其为靶点的治疗研究进展。

(S)-4C3HPG对小鼠中度颅脑创伤后急性期伤情的影响及机制

本文旨在探讨代谢型谷氨酸受体调节剂(S)-4C3HPG在颅脑创伤急性期中的作用。将C57BL/6小鼠分为治疗组和对照组,分别复制颅脑创伤模型,治疗组在致伤前30min使用低、中、高3种剂量(1、5、10mg/kg)的(S)-4C3HPG行腹腔注射,对照组使用生理盐水。致伤24h后进行神经功能缺损评定,干湿重法测定伤侧皮层脑含水量,高效液相色谱测定脑脊液中谷氨酸浓度,实时荧光定量PCR法测定伤侧皮层炎症因子TNF-α和IL-1βmRNA的表达水平。结果显示注射(S)-4C3HPG可减轻神经功能缺损(P<0.05)和脑水肿(P<0.01),同时降低脑脊液中谷氨酸含量(P<0.01)和伤侧皮层TNF-α(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)的mRNA水平,并且此效应存在量效依赖关系。本研究初步证实(S)-4C3HPG可通过抑制谷氨酸释放及炎症介质产生,从而减轻颅脑创伤急性期的损伤。

小鼠颅脑创伤急性期腺苷A2A受体对垂体-肾上腺轴应激反应的影响

目的研究腺苷A2A受体在中度颅脑创伤急性期垂体-肾上腺轴应激反应中的作用。方法将野生型、基因敲除小鼠各18只按随机数字表法分别分为正常对照组、伤后4，24h组，每组6只。使用腺苷A2A受体基因敲除小鼠和野生型C57BL／6小鼠复制颅脑创伤模型，ELISA法测定伤后4h和24h血浆中促肾上腺皮质激素（adrenoeorticotropichormone，ACTH）和皮质酮浓度。结果野生型伤后4，24h组脑含水量分别为（80．950±0．184）％、（82．178±0．255）％，基因敲除伤后4，24h组脑含水量分别为（80．006±0．199）％、（81．091±0．295）％，均高于各自对应的正常对照组（P〈0．01），且野生型损伤组脑含水量高于基因敲除损伤组（P〈0．01）。基因敲除正常对照组血浆ACTH浓度为（120．2144-2．472）ng／L，皮质酮浓度为（27．814±0．888）μg/L，均高于野生型正常对照组（91．767±7．395）ng／L和（11．430±0．644）μg/L（P〈0．01）。基因敲除损伤组血浆ACTH浓度4h为（174．776±5．040）ng／L，24h为（189．613±4．802）ng／L；皮质酮浓度4h为（40．138±0．805）μg/L，24h为（37．440±0．485）μg/L。野生型损伤组血浆ACTH浓度4h为（119．594±6．945）ng／L，24h为（124．93±11．0017）ng／L；皮质酮浓度4h为（19．702±0．804）μg/L，24h为（17．602±0．743）μg/L，基因敲除损伤组增高幅度显著高于野生型损伤组（P〈0．05）。结论敲除腺苷A2A受体在中度颅脑创伤急性期可增加ACTH和皮质酮释放，对垂体一肾上腺轴应激反应有促进作用，为敲除A2A受体发挥神经保护作用提供了新的解释。

地塞米松抑制U937细胞黏附与吞噬功能的作用机制

目的探讨地塞米松抑制单核细胞U937黏附和吞噬功能的机制。方法检测体外培养的U937在佛波脂（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）刺激下分别接受地塞米松和法舒地尔作用后，观察人脐静脉内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）黏附和吞噬能力的变化，并检测ROCKl（rho—associatedcoiled—coilproteinkinase1，ROCK1）蛋白含量及其活性的变化；同时观察米非司酮和放线菌酮对地塞米松的影响。结果地塞米松和法舒地尔均可显著抑制受PMA刺激的U937细胞的黏附率和吞噬效果，并抑制ROCK1活性；米非司酮和放线菌酮并不能影响地塞米松抑制U937细胞的黏附和吞噬作用。结论地塞米松能通过抑制U937细胞内ROCK1的活性而干扰其黏附、吞噬功能。